化学发光酶免疫法检测血清GP73的临床应用

白 晶 张立军 展玉涛 郭 多 刘向祎*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院检验科， 北京 100073; 2.首都医科大学附属北京同仁医院肝胆外科， 北京 100073; 3.首都医科大学附属北京同仁医院消化内科， 北京 100073; 4.首都医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，北京 100069)



化学发光酶免疫法检测血清GP73的临床应用

白 晶1张立军2展玉涛3郭 多4刘向祎1*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院检验科， 北京 100073; 2.首都医科大学附属北京同仁医院肝胆外科， 北京 100073; 3.首都医科大学附属北京同仁医院消化内科， 北京 100073; 4.首都医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，北京 100069)

目的 利用新研发的磁颗粒化学发光法(magnetism particulate chemiluminescence immunoassay， MP-CLIA)替代酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝硬化、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等多种临床样本的血清高尔基体蛋白73(Golgi protein 73，GP73)浓度，进一步探讨MP-CLIA检测血清GP73的临床应用价值。方法 采用建立的MP-CLIA法分别检测健康对照者及各种病人血清GP73浓度，并进行分组比较分析。分别计算MP-CLIA和ELISA 2种方法检测GP73诊断HCC的受试者工作特征(receiver operating characteristic， ROC)曲线下面积。测定50例肝硬化病人和69例HCC病人血清GP73和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)浓度，比较GP73和AFP对HCC的临床诊断效能。同时，对69例HCC病人进行分期比较GP73浓度，对其他良性肝病和其他肿瘤组分别与健康对照组比较分析血清GP73浓度。 结果 MP-CLIA与ELISA 两种方法测定血清GP73在HCC诊断中的ROC曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05)。肝细胞癌组、肝硬化组和健康对照组的血清GP73浓度差异有统计学意义(P<0.05)。肝细胞癌中T1期、T2期、T3期和T4期的血清GP73浓度分别为1.88 nmol/L，2.72 nmol/L，3.22 nmol/L和3.44 nmol/L，早期HCC组与肝硬化组和晚期HCC组比，差异均有统计学意义(P<0.05)。自身免疫性肝炎、脂肪肝、病毒性肝炎和HCC高危人群血清GP73浓度与健康对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。其他肿瘤组的GP73浓度与对照组和HCC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 MP-CLIA法测定血清GP73结果可靠，GP73是一个HCC早期诊断的血清标志物。

高尔基蛋白73； 化学发光法； 肝细胞癌

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前世界上致死率高的恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。临床上很难早期发现HCC，往往发现时就是晚期，已失去了最好的救治机会，因此临床迫切需要一个HCC早期诊断指标。目前甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)仍然是临床上最常用的HCC筛查监测血清标志物，其诊断HCC的敏感性比较低为39%～64%，这就要求临床寻求更灵敏的早期HCC筛查标志物。高尔基体蛋白73(Golgi protein 73，GPB)是2000年发现的一种定位高尔基体的跨膜糖蛋白，又称为Ⅱ型高尔基体膜蛋白。因其相对分子量为73 000，故称为GP73。在正常情况下，GP73主要在胆管上皮细胞中表达，很少在肝细胞中表达。但在HCC病人血清中GP73浓度明显升高[1]。近几年，国内外已广泛开展GP73在HCC诊断方面的研究[2]。但其血清检测方法仅限于酶联免疫方法，缺乏特异灵敏线性范围宽的自动化方法。笔者已在前期研究[3]中建立了灵敏、特异和检测范围宽的磁颗粒化学发光法(magnetism particulate chemiluminescence immunoassay，MP-CLIA)，在本研究中进一步探讨MP-CLIA检测GP73在HCC诊断和其他疾病中的临床应用，从而揭示血清GP73作为HCC早期预警的临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究选取121例2012年12月到2013年12月来北京同仁医院体检科的健康体检人员作为健康对照组，平均年龄(44.4±9.1)岁，男性63例，女性58例。肝细胞癌(HCC)组，收集2012年5月至2014年7月HCC首次诊断住院病人69例，诊断符合2012版《原发性肝细胞癌的临床诊断标准》[4]，平均年龄(53.9±5.8)岁，男性36例，女性33例，T1期7例，T2期16例，T3期 25例，T4期21例，早期HCC 25例(T1+ T2)，晚期46例(T3+T4)；肝硬化组(50例)，平均年龄(44.4±9.1)岁，男性63例，女性58例，诊断符合2012版《慢性乙型肝炎防治指南》[5]中肝硬化诊断标准，并排除有肝占位病变；病毒性肝炎组(85例)，平均年龄(49.1±9.1)岁，男性44例，女性41例，入组标准乙型肝炎(以下简称乙肝)病毒表面抗原阳性且乙型肝炎病毒肝E抗原阳性的病人，丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase， ALT)高于正常值2倍，根据临床、B 超、CT 等综合检查排除肝硬化和肝占位病变；脂肪性肝炎组(102例)：平均年龄(45.7±6.8)岁，男性59例，女性43例，临床影像学诊断为脂肪肝中重度病人，并排除有肝占位病变、肝炎、肝硬化；自身免疫性肝炎组(30例)：平均年龄(40.5±7.1)岁，男性13例，女性17例，入组标准是自身抗体阳性血中抗核抗体和抗平滑肌抗体阳性，ALT高于正常值2倍，B超提示有肝、脾肿大，并根据临床、B 超、CT 等综合检查排除有肝占位病变、肝炎、肝硬化；肝细胞癌高危人群组(50例)，平均年龄(55.8±5.6)岁，男性29例，女性21例，入组标准是单纯乙肝表面抗原阳性，有肝细胞癌、胃癌、结肠癌家族史的高危人群。B超显示没有肝硬化迹象；其他恶性肿瘤组(50例)：平均年龄(50.4±9.1)岁，男性26例，女性24例，病理诊断，并排除肝癌、肝炎、肝硬化、肝胆囊肿。

1.2 样本收集

病人入院生物化学待检清晨空腹静脉血4 mL，离心分离血清后完成正常检测项目的剩余血清，置于-80 ℃以下冰箱保存，待检测GP73和AFP。本研究经首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会批准。

1.3 MP-CLIA法测定血清GP73

在试管中加样本15 μL，加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC)FITC标记抗体45 μL，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)标记抗体45 μL，混匀，37 ℃ 温育16 min。加入抗FITC磁微粒试剂30 μL，混匀，37 ℃温育10.5 min。放置磁板上分离后弃去上清。加入300 μL稀释后的洗液进行清洗，重复清洗2次。弃上清液后放到半自动化学发光免疫分析仪上进行检测。

1.4 ELISA法测定血清GP73

用加液器在微孔板每孔加入50 μL样本稀释液。分别在相应孔中加入校准品或待测样本20 μL，轻轻振荡混匀。用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。每孔中加入酶联试剂100 μL，轻轻振荡混匀。温育：用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。用洗涤液充分洗涤5 次。每孔加入显色液A、B液各50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色15 min。测定：每孔加终止液50 μL，混匀，设定酶标仪波长于450 nm 处，用空白孔调零点后测定各孔A值。使用log-log 线性拟和计算结果。采用化学发光免疫分析仪及试剂盒检测AFP。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料不符合正态分布，采用独立样本非参数检验；计数资料比较采用χ2检验；诊断临界值、敏感度和特异度采用ROC判定；敏感度、特异度比较采用r检验，曲线下面积比较采用Z检验。采用Spearman方法进行相关分析。多组比较采用Kruskal-WallisH检验，两两比较采用Mann-WhitneyU检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 健康对照组、病毒性肝炎组、肝硬化组和HCC组GP73血清浓度

血清GP73浓度在病毒性肝炎组、肝硬化组和HCC组依次升高，在健康对照组、肝炎组、肝硬化组和HCC组之间，血清 GP73 浓度均差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1 3组肝病与健康对照组之间血清GP73浓度比较

GP73:Golgi protein 73.

2.2 肝硬化组和HCC组血清GP73和AFP比较

在69例肝细胞癌病人血清中检出GP73阳性例数为43例，阳性检出率为62.3%：检出AFP阳性例数为33例，阳性检出率47.8%，GP73的阳性检出率要高于AFP，差异有统计学意义(P<0.05)。在50例肝硬化病人血清中检出GP73阳性例数为14例，阳性检出率为28.0%；检出AFP阳性例数为6例，阳性检出率为12.0%，GP73的阳性检出率要明显高于AFP，差异有统计学意义(P<0.05)。比较肝细胞癌组和肝硬化组GP73和AFP相关性，肝细胞癌组GP73和AFP呈明显的正相关(P=0.037)，但肝硬化组GP73和AFP无明显的相关(P>0.05)，详见表1。

2.3 血清GP73诊断HCC的ROC分析

以健康对照组、病毒性肝炎组和脂肪肝组为对照，绘制用ELISA法和CLIA法测定血清GP73对HCC诊断的ROC曲线(图2A)。从ROC曲线确定CLIA法测定GP73诊断HCC的临界值为1.66 nmol/L，敏感度为75.2%，特异度为85.6%，曲线下面积为0.83。而ELISA 法测定GP73诊断HCC的临界值1.80 nmol/L，敏感度为73.8%，特异度为83.6%，曲线下面积为0.820。2个方法测定GP73得到的曲线下面积差异有统计学意义(P>0.05)。

绘制GP73和AFP联合检测诊断HCC的ROC曲线，图2B显示敏感度为77.5%，特异度为95.1%，ROC曲线下面积为0.90，与GP73的ROC曲线下面积0.83比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 GP73与HCC分期的关系

HCCT1期、T2期、T3期和T4期的血清GP73浓度分别为1.88 nmol/L、 2.72 nmol/L、3.22 nmol/L和3.44 nmol/L，但各组之间差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

表1 肝硬化组和HCC组血清GP73和AFP比较

图2 ELISA和CLIA 2种方法检测GP73并诊断HCC的ROC曲线分析

A: two methods for GP73 diagnosis of HCC with ROC; B:combined diagnosis of HCC with ROC by GP73 and AFP.ELISA：enzyme linked immunosorbent assay； CLIA：chemiluminescence immunoassay； GP73：Golgi protein 73； HCC：hepatocellular carcinoma； ROC：receiver operating characteristic； AFP：alpha-fetoprotein.

图3 HCC组四期血清GP73变化

早期HCC(T1期和T2期)和晚期HCC(T3期和T4期)2组GP73浓度分别为2.14 nmol/L和3.33 nmol/L，发现晚期比早期HCC组GP73浓度显著性提高(P<0.05)比对早期HCC和肝硬化的血清GP73水平，2者差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 血清GP73在其他肝脏疾病及其他癌症组中的意义

脂肪性肝炎组、自身免疫性肝炎组、病毒性肝炎和肝细胞癌高危组血清GP73浓度均与健康对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(图4A)。测定AFP，结果显示在HCC高危人群，血清GP73浓度与健康对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05图4)，与病毒性肝炎组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。GP73在HCC高危人群组阳性率2%，而AFP没有阳性。

其他肿瘤组与健康对照组之间血清GP73浓度比较，如图4B所示，其他肿瘤的GP73浓度比较与对照组和HCC组均差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

HCC是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率及病死率高，主要的病因学是乙型肝炎病毒感染。早诊、早治是改善其预后的关键。AFP是目前使用最广泛的诊断HCC的血清标志物，但其敏感度约56.3%，作为早期HCC诊断的手段尚不理想。因此，寻找在肝硬化发展为HCC的早期阶段新的血清肿瘤标志物具有重要社会和经济意义，可以更好地指导临床治疗，并提高病人的生存质量，节省大量医疗资源。有研究[1]表明，GP73在HCC诊断方面的敏感度优于AFP，有望成为新型血清HCC早期诊断标志物。

GP73是一个高尔基跨膜糖蛋白，在蛋白酶作用下发生水解反应，裂解其胞外结构域，释放到细胞外液中，从而为能够在血清中检测出GP73提供依据。2000年，Kladney等[6]首先阐述了GP73在正常情况下主要由胆管上皮细胞表达，而在肝细胞中表达很少甚至不表达。Marrero 等[7]对352例血清标本进行蛋白质印迹技术分析，发现HCC病人血清 GP73浓度显著高于肝硬化病人，早期发现HCC的敏感度明显高于AFP，提示 GP73可能成为一种有潜在价值的 HCC 诊断标志物。

图4 GP73在其他肝脏疾病及其他癌症组中的比较

A: serum GP73 level in benign liver disease group; B: serum GP73 level in HCC and other cancers group;GP73:Golgi protein 73.

在本研究中，取代蛋白印迹这半定量的方法，用MP-CLIA检测健康体检者及HCC等许多临床样本血清GP73浓度。为了研究血清GP73在HCC的诊断价值，本研究比较了健康对照组与病毒性肝炎病人、肝硬化病人和HCC病人的血清GP73 浓度，它们依次呈上升趋势，各组差异均有统计学意义(P<0.05)。HCC病人血清 GP73 浓度显著高于前3组，与文献[6]报道一致。研究初步表明血清GP73可能是一个血清学HCC诊断指标。推测在病毒性肝炎期，血清 GP73的升高可能是一种生理性或者自然状态下的肝细胞受损后修复过程，而在肝硬化和HCC阶段，血清GP73浓度升高可能代表的是一种病理性的肝细胞受损后修复过程。此外，本研究分别用ELISA法和MP-CLIA法测定各组血清GP73浓度，通过计算ROC曲线下面积等指标评价2种方法，结果显示2种方法的曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05)，证明本研究前期研究建立的化学发光法临床样本-验证成功。因为GP73诊断HCC的ROC曲线下面积为0.70～0.95，本方法测定的GP73对HCC的诊断效能是中等水平。结果与文献[8-9]报道一致，表明MP-CLIA方法可靠，血清GP73可能作为诊断HCC的血清肿瘤标志物，能在临床推广使用。

AFP作为 HCC 筛查和诊断的经典标志物，目前仍在临床工作中被广泛地应用。但是，临床工作的难点就是不能有效鉴别AFP呈低浓度(AFP<2.90 nmol/L)的HCC病人和肝硬化病人，特别是影像学阴性而AFP呈低浓度的 HCC 病人，不能早期诊断会导致HCC较差的预后。本研究在36例AFP呈低浓度的肝细胞癌病人中GP73检出阳性(GP73≥1.65 nmol/L)的病人有20例，占AFP低浓度肝细胞癌病人的44%。表明GP73对AFP低浓度的肝细胞癌病人有一定的诊断价值[10]，提示GP73对HCC早期诊断可能有很好的筛查价值。

本研究还发现，随着HCC分期的提升，T1期、T2期、T3期 和T4期4期血清GP73浓度也逐步升高，但各组间差异无统计学意义(P>0.05)，这提示GP73可能是早期诊断标志物，这与国内报道[11]一致。在分析血清GP73和良性肝脏疾病的关系中，我良性肝脏疾病组血清GP73浓度均与健康对照组相比有显著性增高。研究[12-14]报道，血清GP73浓度与慢性肝炎病理分期有很强相关性。各良性肝病组血清 GP73 表达与ALT 有一定相关性，提示可能GP73 的表达、调节与肝脏细胞通透性损伤有关系。

本研究中也同时检测GP73和AFP，结果显示HCC高危人群组GP73浓度与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。GP73在HCC高危人群组阳性率2%，而AFP没有阳性，从而一定程度上说明GP73对HCC早期预警可能有些意义，当然这需要扩大样本，同时追踪随访进行验证。

理想的肝细胞癌血清标志物不仅需要有较高的敏感度，可以将早期HCC诊断出来，也需要有较高的特异度，可以将HCC与肝脏良性疾病(包括肝炎、肝硬化)相区分，同时还需与其他部位的肿瘤区别开。目前近年来的研究[15-17]发现，GP73不仅在HCC中高表达，在胃癌、前列腺癌、肺癌、肾癌等多种肿瘤组织中呈高表达状态，在多种肿瘤的诊断中具有一定临床价值。这在一定程度上消减了GP73对于HCC的诊断价值。本研究50例其他肿瘤的GP73浓度，结果发现其他肿瘤GP73浓度与健康对照组和肝细胞癌组差异均有统计学意义(P<0.05)，也说明GP73在肺癌、结直癌和胃癌也一定程度升高，与正常对照组相比，差异有统计学意义。由于病例有限，结果应进一步扩大临床样本验证。

总之，本研究利用MP-CLIA检测血清GP73，发现GP73在HCC病人中浓度显著升高，本方法测定的GP73对HCC的诊断效能是中等水平，是一个较好的肝细胞癌早期诊断标志物，期待大规模多中心的临床验证。

[1] Mao Y， Yang H， Xu H， et al. Golgi protein 73 (GOLPH2) is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma[J]. Gut，2010，59(12):1687-1693

[2] 霍群，郑泽辉，刘杰，等. 高尔基体蛋白73及去γ-羧基凝血酶原联合甲胎蛋白检测对肝癌的诊断价值[J].中华医学杂志，2015，95(10)：757-760

[3] Liu X Y， Wan X H， Zhan Y T， et al. Golgi protein 73(GP73)C，a useful serum marker in liver disease[J].Clin Chem Lab Med， 2011，49(8):1311-1316.

[4] 李慧，黄祥磊，刘妍.GP73联合其他肿瘤标志物检测对AFP阴性原发性肝细胞癌临床诊断价值[J].标记免疫分析与临床， 2016，23(4)：395-412

[5] 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J]. 肝脏， 2011，16(10): 1-16.

[6] Kladney R D， Bulla G A， Guo L. GP73， a novel Golgi-localized protein upregulated by viral infection[J]. Gene， 2000， 249(1-2):53-65

[7] Marrero J A， Romano P R， Nikolaeva O， et al.GP73， a resident Golgi glycoprotein， is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol， 2005，43(6):1007-1012

[8] Tian L， Wang Y， Xu D， et al. Serological AFP/Golgi protein 73 could be a new diagnostic parameter of hepatic diseases[J]. Int J Cancer，2011，129(8): 1923-1931

[9] Hu J， Wu D， Liang S， et al. GP73， a resident Golgi glycoprotein， is sensibility and specificity for hepatocellular carcinoma of diagnosis in a hepatitis B-endemic Asian population[J]. Med Oncol， 2010，27(2):339-45

[10] Zhou Y， Yin X， Ying J， et al. Golgi protein 73 versus alpha-fetoprotein as a biomarker for hepatocellular carcinoma: a diagnostic Meta-analysis[J]. BMC Cancer， 2012，12:17

[11]Qiao Y， Chen J， Li X， et al. Serum GP73 is also a biomarker for diagnosing cirrhosis in population with chronic HBV infection[J]. Clin Biochem， 2014，47(16-17):216-222

[12]Wei H， Li B， Zhang R， et al.Serum GP73， a marker for evaluating progression in patients with chronic HBV infections[J]. PLoS One，2013，8(2): 53-62.

[13]Zhang F， Gu Y， Li X， et al. Up-regulated Golgi phosphprotein 2(GOLPH2) expression in lung adenocarcinoma tissue[J]. Clin Biochem， 2010， 43(12): 983-991.

[14]翁洋，王吉魁，温艳惠，等.血清AFP、CEA、CA19-9和CA125检测在原发性和转移性肝细胞癌诊断中的临床价值[J].中国医科大学学报，2016，45(5)：470-472.

[15]赵书云， 赵洁，刘杰，等.血清胰蛋白酶原-2对肝细胞癌的诊断价值[J].解放军医药杂志，2015，27(2)：4-7.

[16]马庆庆，黄建廷，童华波，等.血清标志GlyPican-3对肝细胞癌诊断价值初步评价[J].中华肿瘤防治杂志，2014，21(2):127-130.

[17]黄进发，许正锯，潘兴南，等.GP73与HBV相关性肝硬化代偿期病人肝功能的相关性分析[J].临床误诊误治，2015，28(12):99-101.

编辑 慕 萌

Chemiluminescence immunoassay for Golgi protein 73 in human serum and its clinical application

Bai Jing1， Zhang Lijun2， Zhan Yutao3， Guo Duo4， Liu Xiangyi1*

(1.DepartmentofLaboratory，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity,Beijing100073，China; 2.DepartmentofHepatobiliarySurgery，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100073，China; 3.DepartmentofGastroenterology，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100073，China; 4.DepartmentofHumanAnatomyandHistoembryology，SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

Objective To detect serum Golgi protein 73(GP73) by chemiluminescence immunoassay(MP-CLIA) and further investigate its clinical applications with a variety of clinical samples including hepatocellular carcinoma (HCC)， liver cirrhosis and hepatitis. Methods In our study， the serum GP73 level was measured among healthy controls and patients groups by MP-CLIA. The MP-CLIA and ELISA method were evaluated in HCC diagnosis by means of calculating the area under the receiver operating characteristic (ROC). We also measured serum GP73 and alpha-fetoprotein (AFP) in 50 cirrhosis and 69 HCC patients and further compared the effectiveness GP73 and AFP of clinical diagnosis for HCC. We investigated the early diagnosis value of serum GP73 by comparing with different pathological stages of 69 HCC. We also compared the serum GP73 level of healthy controls with that of other benign liver diseases and other cancers. Results It was shown that there was no statistical difference (P>0.05) as to the ROC between the above two methods. It was also shown that the levels of serum GP73 were statistically significant among HCC group， liver cirrhosis group and control group (P<0.05). Serum GP73 level in T1， T2， T3， and T4 stage of HCC were 1.88nmol/L， 2.72nmol/L， 3.22nmol/L and 3.44 nmol/L， respectively. The concentration of serum GP73 in early stage of HCC was significantly different from advanced stage of HCC and liver cirrhosis (P<0.05). As a result， there were also statistical differences of serum GP73 between control group and autoimmune hepatitis， fatty liver， hepatitis， high-risk for HCC group as well as other cancer groups， respectively (P<0.05). Conclusion By clinical preliminary verification， GP73， whose level enhanced in the serum from HCC patients by MP-CLIA， is proved to be a sensitive serum marker in early diagnosis for HCC.

Golgi protein 73; chemiluminescence immunoassay; hepatocellular carcinoma

首都临床特色项目(z141107006614007)， 首都医科大学科研基金-校自然基金(2015ZR07)。This study was supported by Capital Characteristic Clinic Project(z141107006614007)，Research Fund of Capital Medical University-School Natural Foundation(2015ZR07).

时间：2017-07-16 17∶16 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170716.1716.010.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.04.015]

R446.1

2016-11-02)

*Corresponding author， E-mail：13693328516@163.com