低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1结合量和p-Nrf2表达的影响

姬卫秀，何诗依，严 露，张 缨

JI Wei-xiu，HE Shi-yi，YAN Lu，ZHANG Ying

低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1结合量和p-Nrf2表达的影响

姬卫秀，何诗依，严 露，张 缨

JI Wei-xiu，HE Shi-yi，YAN Lu，ZHANG Ying

目的：转录因子NF-E2相关因子（Nrf2）－Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keapl）信号通路是细胞氧化应激反应中的关键通路。普遍认为，长期低氧训练会影响抗氧化能力，研究试图通过对小鼠施加低氧暴露、低氧训练两种方式，探讨其对小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1结合量和Nrf2、Keap1、p-Nrf2蛋白表达以及活性氧（ROS）水平的影响。方法：C57BL/6J小鼠30只，分为3组，分别是对照组（C）、低氧组（H）和低氧训练组（HT）。其中，小鼠跑台训练的跑速为12 m/min，1 h/d，6 d/周，持续4周；低氧浓度为10%，8 h/d，持续4周。干预结束后脱颈处死取后腿两侧骨骼肌。Western Blot法测定骨骼肌Nrf2、Keapl和p-Nrf2的蛋白表达。免疫共沉淀法测Nrf2/Keap1结合量。高质荧光测定法检测小鼠骨骼肌ROS水平。结果：与C组相比，H、HT组小鼠骨骼肌中Nrf2/Keap1结合量显著升高，游离Nrf2显著降低，p-Nrf2蛋白表达显著降低，游离Keap1基本无变化。WHT组ROS水平显著高于WC组。结论：氧浓度为10%的4周低氧暴露和低氧训练均抑制了小鼠骨骼肌Nrf2和Keap1的解绑作用；低氧训练组小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白水平非常显著性降低，可能是造成ROS水平显著升高的原因之一。

低氧；低氧训练；Nrf2/Keap1；p-Nrf2

近年来，低氧训练已成为运动员提高运动成绩的重要辅助手段。研究已表明，低氧训练可影响骨骼肌的抗氧化能力［1，3，4，11］，但其作用机制目前并不十分清楚。

NF-E2相关因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是细胞氧化应激反应中的关键转录因子，可调节靶基因Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表达［11，26］。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keapl），是Nrf2的调节者，对Nrf2功能起负调控作用［19］。在正常情况下，Keapl与Nrf2耦联，并与肌动蛋白结合被锚定于胞浆中，通过泛素化介导Nrf2蛋白降解，从而维持细胞浆内Nrf2处于较低水平［15］。而当机体受到氧化应激刺激后，Keap1蛋白上半胱氨酸的巯基易受到破坏，使其构象发生改变，可促进Nrf2与Keapl偶联作用的解除。同时，氧化应激刺激使Nrf2/Keap1复合物中的Nrf2发生磷酸化（p-Nrf2），加剧其和Keap1的解离作用，也可使游离Nrf2发生磷酸化［10，14］，从而使Nrf2和P-Nrf2在细胞浆中聚集，并转位进入细胞核与Maf蛋白形成杂化二聚体［25］，而后与下游靶基因DNA上的抗氧化元件（ARE）结合，启动其靶基因的转录，成为许多抗氧化基因的开关［17，20］。

运动可以激活Nrf2－ARE通路，增强心肌的抗氧化防御能力，但Nrf2敲除鼠这种作用减弱［22］。也有研究发现，急性运动可使小鼠骨骼肌细胞核Nrf2的蛋白表达升高［5］。在低氧环境中，机体细胞缺氧，会产生一系列的反应。低氧预处理可以激活Nrf2及其靶基因的表达，从而提高大鼠胚胎心肌细胞的生物学功能及抗缺氧能力［16］。沉默Nrf2基因后，低氧导致的内皮细胞凋亡增加，细胞的体外增殖活动减少［28］。但也有研究表明，慢性间歇性低氧暴露4周和8周小鼠心肌组织中Nrf2表达水平下降［8］。在氧浓度为零的极度缺氧环境下培养24 h的人类晶状体上皮细胞，其Nrf2蛋白和mRNA表达降低，导致严重的细胞蛋白破坏［29］。

由上可知，低氧与Nrf2关系密切。然而，低氧暴露和低氧训练如何影响骨骼肌的Nrf2信号及其抗氧化作用，目前并不十分清楚。因此，本研究试图通过动物实验，以Nrf2/Keap1复合物为切入点，探讨4周低氧暴露和低氧训练，对小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1结合量和Nrf2、Keap1、p-Nrf2蛋白表达以及活性氧（ROS）水平的影响，为低氧训练影响骨骼肌抗氧化作用的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

健康8周龄C57BL/6J雄性小鼠（购于维通利华公司实验动物技术有限公司，动物合格证书：SCX-K（京）2009-0004）30只，按体重随机分为3组，分别是对照组（C组），低氧暴露组（H组），低氧训练组（HT组），每组10只。小鼠体重（18.37±2.26）g，每笼3～4只饲养于北京体育大学动物房，动物房温度保持在20～25℃，相对湿度保持在50%～70%，每天光照12 h（7：00～19：00），3组动物均自由进食和饮水。

1.2 干预方案

低氧暴露组小鼠每天暴露在常压低氧环境中8 h（8：00～16：00），氧气浓度为10%，持续4周；通过制氮机（北京创文气体有限公司）、冻干机（杭州超滤）和空气压缩机（美国英格索兰）共同作用将空气中的氮气通入动物饲养室内达到相应氧浓度；低氧训练组的低氧环境与低氧组相同，并在低氧环境下进行跑台运动，经过两天的适应性训练后，进行正式训练，其中，跑速12m/min，坡度为0，每天1 h，每周6天，持续4周。

1.3 取材

最后一次训练结束后，休息48 h脱颈处死，迅速取两侧腿部骨骼肌，用锡纸包裹标记，投于液氮，后转移至－80℃冰箱备后续之用。

1.4 指标测定

1.4.1 提取总蛋白

取100 mg组织，加入800μl含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，超声匀浆，冰上静置30 min，随后12 000 rpm，4℃离心30 min，取上清溶液即为总蛋白。

1.4.2 Western blot

对提取的组织蛋白进行BCA蛋白浓度测定（BCA Protein Assay Reagent，美国Thermo Scientific公司），根据浓度计算配样，上样量为20μg。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝胶（美国life technologies公司）和NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液（美国life technologies公司）进行电泳。之后采用美国Invitrogen公司的iBlot 2将蛋白从电泳凝胶转移至NC膜上。目的条带标记后用5%的脱脂牛奶或BSA封闭1 h后，进行一抗孵育：p-Nrf2（bs-2013R，1：200）、Nrf2（sc-722，1：200）、Keap1（sc-33569，1：500）、内参β-actin（sc-47778，1：1 000），于4℃摇床孵育过夜。次日洗脱一抗后进行二抗孵育1 h：p-Nrf2（羊抗兔，中杉金桥，ZB-2301，1：5 000）、Nrf2（羊抗兔，中杉金桥，ZB-2301，1：2 000）、Keap1（羊抗兔，中杉金桥，ZB-2301，1：5 000）、β-actin（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1：5 000）、。最后，洗脱二抗后加发光液用BIORAD凝胶显影仪器进行显影，用其配套软件进行条带检测与分析。读取灰度值，计算结果，公式如下：

1.4.3 免疫共沉淀

采用免疫共沉淀法测组织胞浆中Nrf2/Keap1的结合量。根据蛋白的浓度，用PBS稀释到1μg/μl；将1 ml已稀释的蛋白溶液中加入到含20μl Protein A/G Mix Magnetic Beads（美国Millipore公司，LSKMAGAG02）的离心管中，4℃摇床2 h，将离心管放到磁力架（美国Millipore公司），转移上清；向上清中加入5μl Nrf2抗体（sc-30915，santa cruz）（Input中加入Nomal goat IgG），4℃摇床过夜；次日加入30 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads，室温摇床2 h，弃上清，PBS清洗3次，加35 μl上样缓冲液洗脱，70℃水浴10 min，转移上清液，重复洗脱第二遍，共吸出上清液70μl。用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝胶（美国life technologies公司）上样30μl进行电泳。之后，采用美国Invitrogen公司的iBlot 2将蛋白从电泳凝胶转移至NC膜上。目的条带标记后用5%的脱脂牛奶封闭1 h后，加入一抗稀释液Keap1（sc-33569，1：500），于4℃摇床孵育过夜。次日洗脱一抗后加入二抗稀释液（羊抗兔，中杉金桥，ZB-2301，1：5 000），室温摇床孵育1 h。最后，洗脱二抗后加发光液用BIO-RAD凝胶显影仪器进行显影。

1.4.4 ROS测定

采用GENMED试剂盒（中国上海杰美基因医药科技有限公司，GMS10016.3）对小鼠骨骼肌ROS进行测定，实验操作严格按照试剂盒的说明书进行。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计处理，数据分析方法为单因素方差分析，用P＜0.05和P＜0.01分别表示具有显著性和非常显著性差异。

2 实验结果

2.1 低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌 Nrf2/Keap1结合量的影响

图1 各组小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1结合量Figure 1 The Nrf2/Keap1 Binding Capacity in Skeletal Muscle of Mice

由图1可知，H、HT组分别与C组相比，小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1复合物结合量显著性增加。

2.2 低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表达的影响

由图2可知，H、HT组分别与C组相比，小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表达量均显著性降低。

2.3 低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌Keap1蛋白表达的影响

由图3可知，H、HT组分别与C组相比，小鼠骨骼肌Keap1蛋白表达均无显著性变化。

2.4 低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表达的影响

图2 各组小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表达量Figure 2 The Expression of Nrf2 in Skeletal Muscle of Mice

图3 各组小鼠骨骼肌Keap1蛋白表达量Figure 3 The Expression of Keap1 in Skeletal Muscle of Mice

由图4可知，间歇低氧暴露后，H组骨骼肌p-Nrf2蛋白表达水平与C组相比显著性下降；低氧训练后，HT组小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表达量与C组相比，非常显著性降低。

2.5 低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌活性氧（ROS）的影响

由图5可知，H组与C组相比，小鼠骨骼肌中ROS水平无显著性变化；HT组与C组相比，小鼠骨骼肌ROS水平显著性升高。

图4 各组小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表达量Figure 4 The Expression of p-Nrf2 in Skeletal Muscle of Mice

图5 各组小鼠骨骼肌ROSFigure 5 The Level of ROS in Skeletal Muscle of Mice

3 分析讨论

3.1 低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌Nrf2、Keap1蛋白表达量和Nrf2/Keap1结合量的影响

缺氧模拟化合物氯化钴（CoCl2）处理小鼠视网膜神经节细胞和骨骼肌卫星细胞，可促进Nrf2从细胞质转位入细胞核，使核内Nrf2蛋白含量增加，进而上调Nrf2介导的抗氧化酶基因的转录［6，7］。Nrf2作为氧化应激反应的关键调节者，急性运动后小鼠心脏和骨骼肌细胞Nrf2核蛋白表达显著增加［18，22］。6周中等强度运动训练可提高年轻和年老小鼠心脏细胞Nrf2核蛋白的水平，从而使抗氧化酶的表达增强［13］。也有研究发现，4周和8周的慢性间歇低氧暴露，小鼠心肌组织中Nrf2表达水平下降［8］。在本研究中，低氧暴露、低氧训练这两种干预作用下，小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表达量均显著性降低，且两种干预方式间无显著性差异。这种Nrf2蛋白表达量的降低可能与实验动物所处低氧环境的氧浓度有关。

有研究提出，Keap1与Nrf2的相互作用遵循着“开放”和“闭合”不同构象的循环方式。“开放”构象即1个Nrf2分子结合1个Keap1分子；“闭合”构象即1个Nrf2分子结合两个Keap1分子。当机体受到氧化应激刺激时，处于安静“开放”状态的分子可被诱导呈现为“闭合”态，从而释放出1个游离Nrf2分子，而Keap1结合数量仍保持不变，游离Keap1未被释放［9］。因此，在本研究中，低氧暴露、低氧训练两种干预作用下小鼠骨骼肌游离Keap1蛋白表达无显著性变化，可能与此相关。

Nrf2/Keap1复合物是Nrf2和Keap1结合物。在本研究中，低氧暴露、低氧训练两种干预作用下，小鼠骨骼肌Nrf2/ Keap1结合量均显著增加。说明两种干预方式使得Nrf2/ Keap1复合物的解离作用减弱，是造成游离Nrf2蛋白水平降低的重要原因。

3.2 低氧、低氧训练对小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表达和ROS水平的影响

机体受到氧化应激后，Nrf2蛋白磷酸化（p-Nrf2）与Nrf2一样，在与Keap1解绑、核易位及其靶基因转录过程中也可能发挥着重要调控作用［10，23］。有研究发现，大鼠6周游泳运动后，海马体的p-Nrf2蛋白表达增加［12］。而在本研究中，低氧暴露、低氧训练这两种干预作用下小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表达均降低，且降低程度依次增强，但两种干预方式之间并无显著变化。Nrf2蛋白磷酸化减少可能也会造成p-Nrf2与靶基因的ARE结合活性降低，从而影响靶基因的转录。

生物活性小分子ROS是细胞代谢的产物，正常情况下细胞内ROS的产生和清除能力之间呈现动态平衡。运动、低氧都会影响机体ROS的产生［2，24，27］。在本研究中，低氧暴露、低氧训练这两种干预作用下，低氧训练组小鼠骨骼肌ROS水平显著性增加，说明p-Nrf2蛋白表达的非常显著性降低可能影响了下游抗氧化酶的表达，进而使骨骼肌的ROS水平提高。

4 结论

氧浓度为10%的4周低氧暴露和低氧训练均抑制了小鼠骨骼肌Nrf2和Keap1的解绑作用；且低氧训练组小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白水平非常显著性降低，可能是造成ROS水平显著升高的原因之一。

［1］ 薄海，李玲，段富强，等. 低氧复合运动抑制低氧诱导的骨骼肌线粒体DNA氧化损伤 ［J］. 生理学报，2014，(5)：597-604.

［2］ 薄海，王义和，李海英，等. 耐力训练抑制急性低氧时骨骼肌线粒体生物能学变化：ROS和UCP3的作用 ［J］. 生理学报，2008，(6)：767-76.

［3］ 黄丽英，翁锡全，林文弢，等. 间歇低氧训练对抗氧化酶系统及其适应能力的影响 ［J］. 广州体育学院学报，2007，(2)：111-115.

［4］ 黄丽英，翁锡全，林文弢. 间歇低氧训练活性氧介导基因调控作用的研究 ［J］. 北京体育大学学报，2008，(5)：615-617.

［5］ 李铁瑛，何诗依，刘思雪，等. 急性运动对小鼠骨骼肌核蛋白Nrf2-ARE结合活性的影响 ［J］. 中国运动医学杂志，2015，(07)：649-652，687.

［6］ 刘永，李俊平，罗冬梅. CoCl2预处理对C2C12细胞氧化损伤后增殖和Nrf2表达的影响 ［J］. 中国运动医学杂志，2014，(03)：238-241.

［7］ 裴涌，郝旭红，孙晓楠. 低氧对视网膜神经节细胞中Nrf2及其调控的抗氧化酶表达的影响 ［J］. 解剖科学进展，2016，(01)：26-28.

［8］ 周珊珊. Nrf2与MT的协同作用在保护慢性间歇性低氧所致心脏损伤中的作用 ［D］.长春：吉林大学，2015.

［9］ BAIRD L，LLERES D，SWIFT S，et al. Regulatory flexibility in the Nrf2-mediated stress response is conferred by conformational cycling of the Keap1-Nrf2 protein complex ［J］. Proc Nat Acad Sci U S A，2013，110(38)：15259-15264.

［10］ BLOOM D A，JAISWAI A K. Phosphorylation of Nrf2 at Ser40 by protein kinase C in response to antioxidants leads to the release of Nrf2 from INrf2，but is not required for Nrf2 stabilization/accumulation in the nucleus and transcriptional activation of antioxidant response element-mediated NAD(P)H：quinone oxidoreductase-1 gene expression ［J］. J Bio Chem，2003，278(45)：44675-44682.

［11］ CHEN T I，TU W C. Exercise attenuates intermittent hypoxia-induced cardiac fibrosis associated with sodium-hydrogen exchanger-1 in rats ［J］. Frontiers Physiol，2016，7：462.

［12］ DA SILVA FIORIN F，DE OLIVERRA A P，RIBEIRO L R，et al. The impact of previous physical training on redox signaling after traumatic brain injury in rats：A behavioral and neurochemical approach ［J］. J Neurotrauma，2016，33(14)：1317-1330.

［13］ GOUNDER S S，KANNAN S，DEVADOSS D，et al. Impaired transcriptional activity of Nrf2 in age-related myocardial oxidative stress is reversible by moderate exercise training ［J］. PloS one，2012，7(9)：e45697.

［14］ HAYES J D，MCMAHON M. NRF2 and KEAP1 mutations：permanent activation of an adaptive response in cancer ［J］. Trends Biochemical Sci，2009，34(4)：176-188.

［15］ ITOH K，MIMURA J，YAMAMOTO M. Discovery of the negative regulator of Nrf2，Keap1：a historical overview ［J］. Antioxid Redox Signal，2010，13(11)：1665-1678.

［16］ KOLAMUNNE R T，DIAS I H，VERNALLIS A B，et al. Nrf2 activation supports cell survival during hypoxia and hypoxia/reoxygenation in cardiomyoblasts；the roles of reactive oxygen and nitrogen species ［J］. Redox Bio，2013，1：418-426.

［17］ KWAK M K，WAKABAYASHI N，KENSLER T W. Chemoprevention through the Keap1-Nrf2 signaling pathway by phase 2 enzyme inducers ［J］. Mutat Res，2004，555(1-2)：133-148.

［18］ LI T，HE S，LIU S，et al. Effects of different exercise durations on Keap1-Nrf2-ARE pathway activation in mouse skeletal muscle ［J］. Free Radic Res，2015，49(10)：1269-1274.

［19］ MENEGON S，COLUMBANO A，GIORDANO S. The dual roles of Nrf2 in cancer ［J］. Trends Mol Med，2016，22(7)：578-593.

［20］ MIN K J，KIM J H，JOU I，et al. Adenosine induces hemeoxygenase-1 expression in microglia through the activation of phosphatidylinositol 3-kinase and nuclear factor E2-related factor 2 ［J］. Glia，2008，56(9)：1028-1037.

［21］ MOI P，CHAN K，ASUNIS I，et al. Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2)，a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region ［J］. Proc Nat Acad Sci U S A，1994，91(21)：9926-9930.

［22］ MUTHUSAMY V R，KANNAN S，SADHAASIVAM K，et al. Acute exercise stress activates Nrf2/ARE signaling and promotes antioxidant mechanisms in the myocardium ［J］. Free Radic Bio Med，2012，52(2)：366-376.

［23］ NGUYEN T，YANG C S，PICKETT C B. The pathways and molecular mechanisms regulating Nrf2 activation in response to chemical stress ［J］. Free Radic Bio Med，2004，37(4)：433-441.

［24］ SACHDEV S，DAVIES K J. Production，detection，and adaptive responses to free radicals in exercise ［J］. Free Radic Bio Med，2008，44(2)：215-223.

［25］ SEKHAR K R，RACHAKONDA G，FREEMAN K L. Cysteine-based regulation of the CUL3 adaptor protein Keap1 ［J］. Toxi Appl Pharmacol，2010，244(1)：21-26.

［26］ SUZUKI T，YAMAMOTO M. Molecular basis of the Keap1-Nrf2 system ［J］. Free Radic Bio Med，2015，88(Pt B)：93-100.

［27］ YAN Z. Exercise，PGC-1alpha，and metabolic adaptation in skeletal muscle ［J］. Appl Physiol，Nut，Metab，2009，34(3)：424-427.

［28］ ZHAO R，FENG J，HE G. Hypoxia increases Nrf2-induced HO-1 expression via the PI3K/Akt pathway ［J］. Front Biosci (Landmark ed)，2016，21：385-396.

［29］ ZHENG X Y，XU J，CHEN X I，et al. Attenuation of oxygen fluctuation-induced endoplasmic reticulum stress in human lens epithelial cells ［J］. Exp Therapeutic Med，2015，10(5)：1883-1887.

Effects of Hypoxia and Hypoxic Training on Nrf2/Keap1 Binding Capacity and p-Nrf2 Expression in Skeletal Muscle of Mice

Objective：NF-E2-related factor 2(Nrf2)－Kelch-like ECH-associated protein-1 (Keapl) signaling pathway is a key pathway of cell oxidative stress reaction. It is generally believed that the long-term hypoxic training could impact oxidation resistance. This research attempts to apply hypoxic training on mice to study the binding capacity of Nrf2/Keap1 and the contents of Nrf2、Keap1、p-Nrf2proteins in skeletal muscle. Methods：The 30 C57BL/6J mice were divided into three groups：control group (C)，hypoxia group (H)，hypoxic training group (HT). The mice ran on treadmill in speed of 12 m/min，1h/d，6d/week，for 4 weeks. Oxygen concentration in hypoxia chamber was 10%. Mice were treated for 4 weeks，8h/d. After both the interventions，the mice were sacrificed and collected skeletal muscle of legs. The expression of Nrf2，Keap1 and p-Nrf2were analyzed by western blot. High quality fluorescence assay was done to detect ROS level in skeletal muscle of mice. Result：Compared with C group，Nrf2/Keap1 binding capacity in skeletal muscle of H、HT groups mice was significantly increased while free Nrf2 and p-Nrf2were significantly reduced respectively；Free Keap1 did not change in skeletal muscle of mice；The ROS level in skeletal muscle of HT group mice significantly increased compared with C group mice. Conclusion：Hypoxia and hypoxic training which oxygen concentration was 10% could reduce the Nrf2/Keap1 unbinding capacity in skeletal muscle of mice. The exerpression of p-Nrf2in skeletal muscle of mice in hypoxic training group was significantly reduced，which may result in marked increase in ROS level.

hypoxia；hypoxic training；Nrf2/Keap1；p-Nrf2

1002-9826（2017）04-0114-05

10. 16470/j. csst. 201704016

G804.2

A

2016-11-28；

2017-05-24

国家自然基金项目（31471134）；中央高校基本科研业务费资助；北京体育大学自主课题（2016BS004）。

姬卫秀，女，博士研究生，主要研究方向为运动与骨骼肌代谢，E-mail：jwx8918@163.com。

张缨，女，北京人，博士，博士研究生导师，研究方向为运动与骨骼肌代谢，E-mail：zhyi9256@126.com，Tel：（010）62989584

北京体育大学 运动人体科学学院，北京 100084

Beijing Sports University，Beijing 100084，China.