番荔枝内酯类化合物基于耐阿霉素肝癌细胞SMMC—7721/ADR的构效关系研究

王绪楠+李祥+陈勇+李月

[摘要] 研究12种番荔枝内酯类化合物对耐阿霉素肝癌细胞SMMC-7721/ADR的作用，并初步探究其构效关系。实验利用实时荧光定量PCR法检测12种番荔枝内酯类化合物：annosquamin A（1），annosquamin B（2），annotemoyin-1（3），uvariamicin Ⅱ（4），annosquacin D（5），annosquacin B（6），isodesacetyluvaricin（7），uvarigrandin A（8），squamostatin D（9），squamostatin E（10），squamostatin A（11），12，15-cis-squamostatin A（12）对SMMC-7721/ADR细胞中相关基因NDUFV2的表达量。该研究发现所有受试化合物均使SMMC-7721/ADR中NDUFV2表达量有所下调，邻双四氢呋喃环型番荔枝内酯活性最强，而间双四氢呋喃环型番荔枝内酯活性最弱。内酯环与邻近的四氢呋喃环间碳数越少，作用越强；对于邻双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物，链上含有的羟基个数越多，化合物作用可能越强；对于间双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物，链上含有的羟基个数越少，化合物作用可能越强；且受试化合物中均是含有3个羟基取代的化合物作用较强；相对构型为苏式的番荔枝内酯的作用比赤式的强，四氢呋喃环为顺式构型的番荔枝内酯的作用比反式的强；在其他基团完全相同的情况下，长链烷基端部与邻近的四氢呋喃环之间的碳数越少，作用越强。

[关键词] 番荔枝内酯；多药耐药；SMMC-7721/ADR；构效关系

[Abstract] The present research was launched to investigate the effects of 12 annonaceous acetogenins （ACGs） on human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721/ADR， and to find out their structure-activity relationship. SMMC-7721/ADR cells were treated with 12 ACGs including annosquamin A（1），annosquamin B（2），annotemoyin-1（3），uvariamicin Ⅱ（4），annosquacin D（5），annosquacin B（6），isodesacetyluvaricin（7），uvarigrandin A（8），squamostatin D（9），squamostatin E（10），squamostatin A（11），and 12，15-cis-squamostatin A（12） for 24 h， and the different expression of the target gene NDUFV2 were detected by quantitative real-time PCR. All the tested compounds made the expression of the target gene NDUFV2 decreased on human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721/ADR， of which the bistetrahydrofuran ACGs showed the best activity，which the non-adjacent bistetrahydrofuran ACGs displayed the worst activity.The ACGs with the reducing number of carbons between γ-unsaturated lactone and the close tetrahydrofuran （THF） ring are more potent. For bistetrahydrofuran ACGs with the same nucleus skeleton，they would be more active as more hydroxyls on aliphatic chain， which for the non-adjacent bistetrahydrofuran ACGs with less hydroxyls on aliphatic chain that would be more active. ACGs with 3 hydroxyls on aliphatic chain would be more active. ACGs with threo configuration are more active than erythro configurotion， and the compounds with cis THF ring seem to be superior to those of trans THF ring. Furthermore， the ACGs with the reducing number of carbons between terminal methyl and the close tetrahydrofuran （THF） ring are more potent.

[Key words] annonaceous acetogenins；multidrug resistance；SMMC-7721/ADR；structure-activity relationship

番荔枝Annona squamosal L.为番荔枝科Annonaceae番荔枝属Annona植物，广泛分布于热带及亚热带地区，我国的广东、广西、云南及海南等南方多数城市均有栽培[1]，据《中华本草》[2]记载：番荔枝科番荔枝属植物番荔枝的干燥成熟种子，性味苦、寒，归心、肺、肝、肾、脾经，其功效為消积杀虫、清热解毒、解郁、止血。番荔枝内酯是从番荔枝科植物中提取分离得到的一类长链内酯类化合物，其基本化学结构为35～37个碳原子构成的化合物骨架，分子中含0～3个四氢呋喃环（tetrahydrofuran，THF），末端有1个甲基取代或经重排的γ-内酯环和2条连接这些部分的长烷基直链，在碳链上还常常带有一些立体化学多变的含氧官能团（羟基、酮基、乙酰氧基、环氧结构等）或者双键[3-6]。目前，已有文献报道，番荔枝内酯具有显著的抗肿瘤作用，尤其是对抑制多药耐药肿瘤细胞的生长[7]表现出强烈的活性。对线粒体的强效抑制作用[8]，从而诱导肿瘤细胞凋亡[9]，杀死肿瘤细胞为其作用机制。本实验前期采用体外线粒体复合酶Ⅰ活性测试、计算机模拟分子对接两种方法，以AGGs对线粒体复合酶Ⅰ的NDUFV2亚基模拟对接，发现AGGs能够与线粒体复合酶Ⅰ的NDUFV2亚基结合位点进行很好结合，为进一步验证AGGs对该亚基的作用，结合番荔枝内酯立体结构的复杂性，其构效关系研究[10]已经成为现代研究的一大热点，本实验选用实验室前期分离得到的 12个番荔枝内酯类化合物，选用实时荧光定量PCR法，主要考察结构中γ-内酯环两环间与邻近的四氢呋喃环的碳数、羟基个数、四氢呋喃环及相邻羟基的构型、长链烷基端部与邻近的四氢呋喃环之间的碳数等因素对SMMC-7721/ADR上目的基因NDUFV2的作用之间的关系，以期进一步探索番荔枝内酯对抗肿瘤作用的机制，并为临床治疗找到一种具有高活性抗多药耐药性肿瘤的化合物结构模型。

1 材料

12个番荔枝内酯化合物annosquamin A（1），annosquamin B（2），annotemoyin-1（3），uvariamicin Ⅱ（4），annosquacin D（5），annosquacin B（6），isodesacetyluvaricin（7），uvarigrandin A（8），squamostatin D（9），squamostatin E（10），squamostatin A（11），12，15-cis-squamostatin A（12）（表1，图1）均为本实验前期分离得到，经HPLC-DAD检测，HPLC纯度均>98%。顺铂（齐鲁制药有限公司）；紫杉醇（北京华素制药有限公司）；阿霉素（浙江海正药企有限公司）；Trizol试剂（南京卡罗登生物科技有限公司）；逆转录试剂盒、SYBR Green染料（TOYOBO，日本）；SMMC-7721/ADR细胞、SMMC-7721细胞、RPMI 1640 培养基（南京凯基生物科技发展有限公司）；DEPC水、胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Biosharp公司，美国）；噻唑蓝（MTT）、PBS磷酸盐缓冲溶液、EDTA（北京索来宝科技有限公司）；乙醇、二甲基亚砜（DMSO）（分析纯，无锡海硕生物有限公司）；丙酮、氯仿（江苏汉邦有限公司）。

超净台（苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2F）；CO₂细胞培养箱（Thermo Scientific HE-RA cell 150i，美国）；酶标仪（Spectra MAX190，Molecular Devices，美国）；超微量核酸蛋白测定仪（NanoDrop，美国）；定量PCR仪qTOWER 2.0（耶拿，德国）。

2 方法

2.1 SMMC-7721/ADR细胞和SMMC-7721细胞的培养

SMMC-7721/ADR细胞株培养于在含20 mg·L^-1阿霉素、10%胎牛血清及1%青霉素、链霉素混合液的RPMI 1640培养基中1周，再培养于不含阿霉素的培养液中2周后进行实验。SMMC-7721细胞培养于在10%胎牛血清及1%青霉素、链霉素混合液的RPMI 1640培养基中。细胞置于CO₂培养箱中，在37 ℃和5% CO₂条件下培养。

2.2 MTT法验证细胞的多药耐药性

取对数生长期细胞SMMC-7721/ADR和SMMC-7721，确定活细胞数大于90%。用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为5×104 个/mL接种于96孔板，200 μL/孔，每孔细胞数约为1×105个。将细胞分为对照组（细胞用培养基培养）、给药组（细胞分别用不同浓度梯度的紫杉醇、阿霉素、顺铂培养），SMMC-7721/ADR细胞给药组的浓度梯度分别为阿霉素（700，350，175，87.5，43.75，21.875，10.937 5，5.468 75，2.734 375 mg·L^-1），紫杉醇（171，85.5，42.75，21.375，10.687 5，5.343 75，2.671 875，1.335 938，0.667 969 mg·L^-1），顺铂（725，362.5，181.25，90.625，45.312 5，22.656 25，11.328 13，5.664 063，2.832 203 1 mg·L^-1）。SMMC-7721细胞给药组的浓度梯度分别为阿霉素（700，350，175，87.5，43.75，21.875，10.937 5，5.468 75，2.734 375 mg·L^-1），紫杉醇（85.5，42.75，21.375，10.687 5，5.343 75，2.671 875，1.335 938，0.667 969，0.333 984 mg·L^-1），顺铂（725，362.5，181.25，90.625，45.312 5，22.656 25，11.328 13，5.664 063，2.832 203 1 mg·L^-1）。將细胞培养24 h后，吸出上清液，对照组加入200 μL/孔培养基，给药组加入200 μL/孔含各浓度梯度的紫杉醇、阿霉素、顺铂的培养基，然后将96孔板置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养24 h。随后每孔加入5 g·L^-1 MTT试剂20 μL，继续培养4 h。轻轻吸出96孔板中培养液，加入DMSO，150 μL/孔，震荡摇匀10 min，使结晶物充分溶解，并在490 nm波长处用酶标仪测定各孔吸光度（A）。采用直线回归法计算药物对SMMC-7721/ADR细胞和SMMC-7721细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）。实验重复3次。

细胞抑制率=（1-A实验组/A对照组）×100%

2.3 实时荧光定量PCR法

取对数生长期细胞SMMC-7721/ADR确定活细胞数大于90%。用RPMI 1640培养液将细胞接种于直径10 cm为培养皿中，将细胞分为对照组（细胞用培养基处理）和给药组（细胞用10 μmol·L^-1的不同番荔枝内酯的培养基处理），培养24 h，将上清液吸出，对照组加入10 mL培养基，给药组加入10 mL含不同番荔枝内酯的培养基，然后将培养皿置于37 ℃，5% CO₂饱和湿度培养箱中培养24 h，弃去上清液，加入10 mL PBS，轻轻振荡，清洗细胞后弃去液体，加入1 mL Trizol试剂裂解细胞，按照Trizol提取细胞总RNA 方法说明书提取总RNA。使用Nonodrop超微量核酸检测仪测定RNA浓度和纯度。根据逆转录反应试剂盒说明书合成cDNA，将合成的cDNA取2 μL按照SYBR Green掺入法配成20 μL反应体系，以HMBS为内参，NDUFV2为目的基因，反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，进行50个PCR循环。熔解曲线：60 ℃以每秒升高5 ℃至95 ℃，95 ℃6 s。qPCR最终实验数据采用2-ΔΔCT法进行分析，ΔΔCT=（CtmiRNA-CtHMBS）给药组-（CtmiRNA-CtHMBS）对照组（表2）。

3.2.1 內酯环与邻近的四氢呋喃环间的碳数对化合物活性的影响 四氢呋喃环与内酯环间的碳数对化合物作用有较大影响。化合物1与2，化合物5与6的相对分子质量、THF的类型、相对构型、OH数均相同，它们仅在四氢呋喃环与γ-内酯环之间的碳原子数不同。单四氢呋喃型番荔枝内酯化合物中，化合物1（2环间碳数为 7个）的下调大于化合物2（2环间碳数为 9个）。此外，邻双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物中，化合物6（2环间碳数为9个）的下调大于化合物5（2环间碳数为11个），由此推测，该类化合物结构中，四氢呋喃环与内酯环间碳数越少，化合物的作用可能越强。

3.2.2 取代羟基个数对化合物活性的影响 取代羟基个数对化合物作用有较大影响。邻双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物7与8的四氢呋喃环与内酯环之间的碳原子数相同、相对构型相同，它们仅在羟基的个数上有所不同。化合物8（有3个羟基）的下调大于化合物7（有2个羟基）。间双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物9与11的四氢呋喃环与内酯环之间的碳原子数相同、相对构型相同，仅在羟基的个数上有所不同，化合物9（有3个羟基）下调大于化合物11（有4个羟基）。由此推测，对于邻双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物，链上含有的羟基个数越多，化合物作用可能越强；对于间双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物，链上含有的羟基个数越少，化合物作用可能越强；且受试化合物中均是含有3个羟基取代的化合物作用较强。

3.2.3 四氢呋喃环及邻位羟基构型对化合物活性的影响 四氢呋喃环的构型对化合物的作用也有较大的影响。化合物9和10，化合物11和12仅在四氢呋喃环的构型上略有不同，间双型四氢呋喃环番荔枝内酯类化合物中，化合物10（构型为trans/threo-threo/trans/threo）的下调比化合物9（构型为trans/threo-threo/trans/erythro）的多。由此推测，具有苏式构型的番荔枝内酯类化合物的作用比具有赤式构型的番荔枝内酯类化合物作用强。化合物12（构型为cis/threo-threo/trans/erythro）的下调比化合物11（构型为trans/threo-threo/trans/erythro）要多。由此推测，四氢呋喃环为顺式构型的番荔枝内酯类化合物作用比反式的强。

3.2.4 长链烷基端部与邻近的四氢呋喃环之间的碳数对化合物活性的影响 四氢呋喃环与长链烷基端部之间的碳数对化合物作用有一定的影响。在单四氢呋喃环型番荔枝内酯类化合物中，化合物3和4的四氢呋喃环与内酯环间的碳数，取代羟基位置、个数，四氢呋喃环及其相邻的取代羟基相对构型都相同，不同之处在于四氢呋喃环与长链烷基端部之间的碳数不同，化合物3（碳数为12个）的下调比化合物4（碳数为14个）强，由此推测，在其他基团完全相同的情况下，四氢呋喃环与长链烷基端部之间的碳数越少，化合物作用越强（表4～6，图2～4）。

4 讨论

通过上述番荔枝内酯类化合物对SMMC-7721/ADR细胞中NDUFV2的影响表明：①所有受试化合物均使SMMC-7721/ADR中NDUFV2表达量有所下调，邻双四氢呋喃环型番荔枝内酯活性最强，而间双四氢呋喃环型番荔枝内酯活性最弱；②内酯环和邻近的四氢呋喃环间碳数越少，活性越强；③对于邻双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物，链上含有的羟基个数越多，化合物作用可能越强；对于间双四氢呋喃型番荔枝内酯化合物，链上含有的羟基个数越少，化合物作用可能越强，且受试化合物中均是含有3个羟基取代的化合物作用较强；④相对构型为苏式的番荔枝内酯的活性比赤式的强，四氢呋喃环为顺式构型的番荔枝内酯的活性比反式的强；⑤在其他基团完全相同的情况下，长链烷基端部与邻近的四氢呋喃环之间的碳数越少，活性越强。结合以上研究，可以为合成高活性抗肿瘤多药耐药的番荔枝内酯类化合物提供理论依据。

化合物8分子式为C₃₇H₆₆O₇，含有3个羟基取代，构型为th/t/th/t/th，四氢呋喃环和内酯环之间碳数位13个的邻双四氢呋喃环型番荔枝内酯，其对SMMC-7721/ADR细胞中NDUFV2表达下调最为显著，结合实验构效分析结构，本文设想了1个化合物结构：总碳原子数为37，羟基数为3个，四氢呋喃环与内酯环间碳数为7个，THF环与邻位羟基的构型为th/c/th/c/th，该化合物可能会对SMMC-7721/ADR细胞中NDUFV2表达下调产生更为显著的影响，化合物结构（图5）。

由本实验结果推测，番荔枝内酯对耐药细胞抑制活性的影响因素主要包括四氢呋喃环与内酯环间的碳数、取代羟基个数、四氢呋喃环构型、四氢呋喃环与长链烷基端部之间的碳数等方面。然而，考虑到立体化学的复杂、多变，这些因素并非单独作用，而是相互影响，综合作用。各因素的影响力度也不一样，这可能与各因素导致番荔枝内酯化合物与受体的结合程度不同有关[11]。同时，这也是该类化合物首次被报导参与线粒体复合酶Ⅰ蛋白的连接，这为后期用于研究逆转多药耐药肿瘤细胞机制研究提供了一定的依据。

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[责任编辑 丁广治]