生物质热解液和壳聚糖复合保鲜剂对辣椒炭疽病菌抑菌作用研究

付长雪,刘芳芳,都璐珩,李范洙,张 先

(延边大学农学院食品科学系,吉林延吉 133000)



生物质热解液和壳聚糖复合保鲜剂对辣椒炭疽病菌抑菌作用研究

付长雪,刘芳芳,都璐珩,李范洙*,张 先*

(延边大学农学院食品科学系,吉林延吉 133000)

为探究生物质热解液在农业生产中的应用及复合保鲜剂开发,采用气相色谱-质谱联用仪分析检测了生物质热解液的化学成分,以辣椒炭疽病菌为实验菌种,用生长速率法进行了生物质热解液和壳聚糖对辣椒炭疽病菌的抑菌实验,通过共毒因子法确定了生物质热解液和壳聚糖的相互作用。结果表明:生物质热解液和壳聚糖对辣椒炭疽病菌的EC50值分别为50倍和0.7 g/L;生物质热解液对辣椒炭疽病菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)分别为32.5倍和29倍;两者以不同比例混合使用时对辣椒炭疽病菌的抑制具有增效作用,且生物质热解液和壳聚糖EC50溶液按1∶1比例混合时共毒因子最大。

生物质热解液,壳聚糖,辣椒炭疽病菌,抑菌作用,复合保鲜剂

生物质资源是地球上存在的一种丰富的可再生能源。我国生物质资源来源主要分四大类:农业资源、林业资源、禽类粪便和能源植物。研究发现,生物质热解技术是生物质资源利用的重要途径[1-2]。

目前,对生物质资源利用的研究主要以木醋液为主,已有大量研究证明其具有促进植物生长和防治农作物病虫害及保鲜的作用[3-5],且安全无毒性[6-7]。研究表明,植物中抗菌、杀菌的有效成分主要有香精油,香精油一般为醋、酮、酸和萜烯的化合物,此外单宁、甾体类、黄酮类、有机酸和蛋白质等也具有抑菌作用[8]。生物质热解液(bio-liquid),是生物质热解技术获得的生物油精制分离得到的水溶性提取物,其化学组成主要有有机酸、醇、酚、醛、酮类等[9],因此推测生物质热解液也具有一定的抗菌杀菌作用。

壳聚糖是一种天然无毒的高聚物,是甲壳素脱乙酰基的产物[10]。存在广泛,且安全、无毒、可降解,具有良好的抗菌性和吸附性。与一般的抑菌剂相比有广谱、抗菌活性高、杀菌率高等优点[11]。

辣椒炭疽病,是危害辣椒的主要病害之一。在高温高湿条件下,流行蔓延快,危害时间长,危害重,损失大[12]。传统的预防措施主要为喷施杀菌剂,尽管达到了防治效果,但辣椒表面残留的杀菌剂对人类健康存在致癌、致畸等慢性毒性。

因此,本实验以生物质热解液为原料,研究其对辣椒炭疽病菌的抑制作用并开发生物质热解液和壳聚糖复合抑菌剂,研究复合保鲜剂对辣椒炭疽病菌抑菌效果,以期为生物质资源的综合利用及绿色复合抑菌剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生物质热解液 2012年广州迪森集团提供,以木屑为原料，采用中温快速热解法制造的生物油,生物油与水按1∶1比例混合,常压蒸馏,收集100～120 ℃时的馏出液；壳聚糖 脱乙酰度大于95%以上，山东省莱州市海力生物制品有限公司；辣椒炭疽病菌 吉林省蔬菜花卉研究院。

Shimadzu QP2010 GC/MS气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司;DHG-9143BS-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱、SW-CJ-1FD型超净工作台 上海新苗医疗器械机械制造有限公司;DNP-9082BS-Ⅲ型电热恒温培养箱 天津泰勒斯仪器有限公司;FA1004B型分析天平 上海昂尼仪器仪表有限公司;SX-700型高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生物质热解液化学成分GC-MS分析 采用气相色谱-质谱联用仪分析Shimadzu QP2010 GC/MS。

色谱条件:色谱柱为DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱。程序升温:柱温50 ℃(保留2 min),以10 ℃/min升温至280 ℃,保持30 min。汽化室温度250 ℃,载气为高纯He(99.999%),流速1.0 mL/min;分流进样,分流比20.0,溶剂延迟时间:1.0 min。

质谱条件:离子源为电子轰击(EI)源;离子源温度230 ℃,电子能量70 eV,接口温度280 ℃。质量分析器为单四极杆,质量范围20～500 amu,检测电压为0.90 kV。

1.2.2 抑菌率和EC50值测定 将不同浓度生物质热解液和壳聚糖分别与高压灭菌(121 ℃、20 min)后冷却至50 ℃左右的PDA固体培养基混合均匀,分别配制成含不同浓度的生物质热解液和壳聚糖的培养基。以不加热解液和壳聚糖的培养基为空白对照(CK)并以含0.05%和0.1%醋酸的培养基为对照。

在已培养4～5 d的辣椒炭疽病菌平板上,用直径为5 mm的打孔器在菌落的外缘生长旺盛处制备菌饼,用接种针挑取菌饼,菌丝面朝下轻放于带药培养基的中心并与培养基贴合[13]。每个培养皿中放置一个菌饼,每个稀释浓度重复3次。

将接种后培养基放置于28 ℃培养箱中培养,培养至空白对照组菌落直径大于培养皿直径的2/3时,用游标卡尺测量辣椒炭疽病菌生长的菌落直径(mm),并得出平均值。通过计算得出各处理浓度对辣椒炭疽病菌的抑菌率,分析比较热解液和壳聚糖对辣椒炭疽病菌菌丝生长的影响。

以横坐标为药剂浓度的对数值,纵坐标为菌丝生长的抑菌率值,得出两种药剂对辣椒炭疽病菌的毒力回归方程,并求得生物质热解液与壳聚糖对辣椒炭疽病菌的EC50值[14]。

抑菌率(%)=[(空白对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)]×100

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)测定 采用直接配制法制备不同稀释倍数的含生物质热解液的PDA液体培养基。采用连续稀释法制备不同稀释浓度的含壳聚糖的PDA液体培养基。将PDA液体培养基倒入试管中,每个试管15 mL,每个浓度3次重复,以不加生物质热解液和壳聚糖的试管为对照组。将制备好的辣椒炭疽病菌菌饼接种在试管中,在28 ℃恒温培养后观察结果,每隔12 h观察一次菌丝的生长情况,连续观察一周,以试管内完全无菌丝生长的最小浓度为药剂对辣椒炭疽病菌的最小抑菌浓度[15]。

在MIC实验基础上,将无菌丝生长的试管中的菌饼接种到PDA培养基中在28 ℃培养箱中培养。一周后判断菌丝生长情况,以此时无菌丝生长的最小浓度为药剂对辣椒炭疽病菌的最小杀菌浓度。

1.2.4 复配实验设计 假设经测定生物质热解液、壳聚糖单剂A、B的EC50值分别为a和b,用共毒因子法评价生物质热解液A和壳聚糖B混合液的增效作用。选择5个配比,具体配制方法即先配制A、B的EC50溶液,再按体积比1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1混合即得不同配比的混和液[16]。

共毒因子=[(混合液实际抑制率-混合液理论抑制率)/混合液理论抑制率]×100

当共毒因子>20,表示有增效作用;≤-20表示有拮抗作用;-20～20表示有相加作用[17]。

1.3 数据分析

用SPSS 11.5和Excel软件对数据进行统计分析

2 结果与分析

2.1 生物质热解液化学成分分析

对生物质热解液化学成分进行GC-MS分析,经数据库检索,并核对质谱标准图谱,各组分的含量按峰面积百分比计算得出,结果见表1。从生物质热解液中共分析鉴定出23种组分,酸类物质相对含量最高,占所有检出物的58.89%,其中醋酸的相对含量为40.34%;其次是胺类物质,占所有检出物的17.84%;酮类物质的相对含量为12.83%,此外还有少量的醇类、酯类、酚类、醛类物质。酸类、胺类、酮类物质的总含量为89.56%,是生物质热解液的主要组成成分。

相较于翟梅枝[18]等人的研究,除醛类物质外,生物质热解液的化学成分与3种不同木醋液的化学成分相似,且与生物油[19]的化学组成种类基本一致,但各物质相对含量有差异。

表1 生物质热解液化学成分分析表Table 1 Chemical composition of bio-liquid

2.2 生物质热解液对辣椒炭疽病菌的抑菌作用

结果表明,生物质热解液对辣椒炭疽病菌有较好的抑菌效果。如表2所示,随着生物质热解液稀释倍数的增加,抑菌效果逐渐减小,在稀释倍数为30倍时,生物质热解液对辣椒炭疽病菌的抑菌率达到100%;当生物质热解液稀释倍数大于60倍时,抑菌率低于50%。相较于魏琦[20]等人的竹醋液对辣椒炭根据生物质热解液稀释倍数与其对辣椒炭疽病菌的抑菌率,求得生物质热解液对辣椒炭疽病菌的毒力回归方程为y=10.848x2-45.259x+50.85,R2=0.98391,通过回归方程得出生物质热解液的EC50值为50倍即20 mL/L,仅为苦参和板蓝根提取物[21]的一半,与金银花提取物EC50值相接近,说明生物质热解液具有良好的抑菌效果。

表2 生物质热解液对辣椒炭疽病菌抑菌作用Table 2 The antifungal activities of bio-liquid against Colletotrichum nigrum

注:同一列中不同小写字母代表差异显著(p<0.05),表4、表6同。疽病菌抑菌效果的研究,相同浓度下,生物质热解液对辣椒炭疽病菌的抑菌效果略低于竹醋液。热解液50倍稀释液的抑菌率相当于0.05%醋酸对照组的抑菌率,40倍稀释液的抑菌率显著大于0.1%醋酸对辣椒炭疽菌的抑菌率。

生物质热解液对辣椒炭疽病菌的最小抑菌浓度见表3及图2。生物质热解液稀释36倍及以上时,试管内均有菌丝生长,在稀释32.5倍及以下的试管中,无菌丝生长,以试管内无菌丝生长的最小浓度为MIC,由此确定稀释32.5倍为生物质热解液对辣椒炭疽病菌的最小抑菌浓度。最小抑菌浓度实验后从无菌丝生长的试管中将菌饼取出接种在PDA培养基中培养,进一步确定生物质热解液对辣椒炭疽病菌的MFC为稀释29倍。

图1 生物质热解液对辣椒炭疽病菌抑菌作用Fig.1 The antifungal activities of bio-liquid against Colletotrichum nigrum

表3 生物质热解液对辣椒炭疽病菌的MIC和MFC测定Table 3 MIC and MFC of bio-liquid against Colletotrichum nigrumon

图2 生物质热解液对辣椒炭疽病菌的MIC和MFC测定Fig.2 Effects of Bio-liquid against Colletotrichum nigrumon MIC and MFC

图3 壳聚糖对辣椒炭疽病菌抑菌作用Fig.3 The antifungal activities of chitosan against Colletotrichum nigrum注：图中左下角的数字为壳聚糖浓度，单位g/L。

注:试管内有菌丝生长用“+”表示,无菌丝生长用“-”表示,表5同。2.3 壳聚糖对辣椒炭疽病菌的抑菌作用

壳聚糖对辣椒炭疽病菌的抑菌作用如表4及图3所示,随着壳聚糖浓度的升高,菌落直径逐渐减小，抑菌率逐渐增加。当壳聚糖浓度大于0.7 g/L时,对辣椒炭疽病菌抑菌率均大于50%,表明壳聚糖对辣椒炭疽病菌也有较好的抑制作用。已有大量研究证明[22-24]壳聚糖作为一种广谱抑菌剂,可以有效抑制多种细菌、真菌的生长和繁殖,一方面,壳聚糖可以和病菌表面产生的酸性物质如磷壁质酸、荚膜多糖等相互作用[25]形成复杂的高分子电解质,改变细胞膜的通透性,使膜功能发生紊乱,细胞内物质电解质、蛋白质和内酶外渗,从而产生抑菌效果;另一方面,大分子的壳聚糖会吸附在微生物细胞表面,形成一层高分子膜,阻止了营养物质向细胞内运输[26]从而起到杀菌和抑菌作用。

表4 壳聚糖对辣椒炭疽病菌抑菌作用Table 4 The antifungal activities of chitosan against Colletotrichum nigrum

根据壳聚糖浓度对数值与抑菌率的几率值求得壳聚糖对辣椒炭疽病菌的毒力回归方程为y=0.55677x2+1.2848x+0.75555,R2=0.98026,得出壳聚糖对辣椒炭疽病菌的EC50值为0.7 g/L。

从表5及图4可以看出,壳聚糖浓度为0.625 g/L以下时,试管中有菌丝生长,壳聚糖浓度1.25 g/L开始,无菌丝生长,以无菌丝生长的最低浓度作为壳聚糖对辣椒炭疽病菌的最小抑菌浓度,即壳聚糖对辣椒炭疽病菌的MIC为1.25 g/L。不同浓度的壳聚糖所对应的平板中均有菌丝生长,说明壳聚糖对辣椒炭疽病菌仅有抑制作用,无杀菌作用。

表5 壳聚糖对辣椒炭疽病菌的MIC测定Table 5 Effects of chitosan against Colletotrichum nigrum on MIC

表6 生物质热解液与壳聚糖不同比例混合液对辣椒炭疽病菌的抑制作用Table 6 The acaricidal activities of mixtures containing different proportions of bio-liquid and chitosan against Colletotrichum nigrum

图4 壳聚糖对辣椒炭疽病菌的MIC测定Fig.4 MIC of chitosan against Colletotrichum nigrum

2.4 生物质热解液和壳聚糖复合保鲜剂对辣椒炭疽病菌的抑菌作用

生物质热解液EC50值溶液与壳聚糖EC50值溶液按照不同比例混合后,通过毒力回归方程求得生物质热解液与壳聚糖对辣椒炭疽病菌的抑菌率,相加即为复合保鲜剂对辣椒炭疽病菌的理论抑菌率。生物质热解液EC50值溶液与壳聚糖EC50值溶液不同混合比例的实际抑菌率、理论抑菌率及相互作用如表6所示。当生物质热解液和壳聚糖复配比例为1∶2、1∶1、2∶1、5∶1时,实际抑菌率均为理论抑菌率的2倍左右,且对应的共毒因子均大于20,表明生物质热解液与壳聚糖配合使用有增效作用。复配比例为1∶5时,共毒因子小于20,表明生物质热解液和壳聚糖仅有相加作用无增效作用。复配比例为1∶1时共毒因子最大,为82.74,即稀释50倍生物质热解液与0.7 g/L壳聚糖按1∶1比例混合作为本实验较好的复配比例。但就抑菌率来看,混合比例为5∶1时对辣椒炭疽病菌的实际抑菌率最大,且显著高于其他混合比例。因此,实际如何应用,还需进一步考虑和验证经济成本以及不同比例混合液对辣椒保鲜效果等问题。此外生物质热解液以及与壳聚糖的复合剂对辣椒炭疽病菌的抑菌机理还有待进一步研究。

图5 生物质热解液与壳聚糖不同比例混合液 对辣椒炭疽病菌的抑制作用Fig.5 The acaricidal activities of mixtures containing different proportions of bio-liquid and chitosan against Colletotrichum nigrum

3 结论

对生物质热解液化学成分进行GC-MS分析,结果表明:酸类、胺类、酮类物质的相对含量占89.56%,是生物质热解液的主要组成成分。以辣椒炭疽病菌为供试植物病原菌,采用生长速率法评价了生物质热解液与壳聚糖的抑菌活性。生物质热解液对辣椒炭疽病菌的EC50值为50倍,最小抑菌浓度为32.5倍，最小杀菌浓度为29倍;壳聚糖对辣椒炭疽病菌的EC50值为0.7 g/L,最小抑菌浓度为1.25 g/L,壳聚糖对辣椒炭疽病菌无杀菌效果。生物质热解液和壳聚糖复合使用对辣椒炭疽病菌的抑菌效果表明:两者之间有增效作用,50倍生物质热解液与0.7 g/L壳聚糖溶液1∶1比例的混合液增效作用最大。

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Study on the antibacterial effect of bio-liquidand chitosan compound preservative onColletotrichumnigrum

FU Chang-xue,LIU Fang-fang,DU Lu-heng,LI Fan-zhu*,ZHANG Xian*

(College of Agriculture,Yanbian University,Yanji 133000,China)

In order to explore the application of bio-liquid in agricultural production and preservative development,Gas chromatograph mass spectrometer was used to analyze the chemical composition of bio- liquid,Colletotrichumnigrumwas used as experimental strain,antibacterial experiment of bio-liquid and chitosan onColletotrichumnigrumwere experimented by growth rate method,and the interation between bio-liquid and chitosan was determined by the co-toxity factor method.The results showed that EC50of bio-liquid and chitosan onColletotrichumnigrumwere 50 times and 0.7 g/L. The minimum inhibitory concentration of biomass pyrolysis liquid on Pepper Anthracnose(MIC)and minimum bactericidal concentration(MFC)were 32.5 times and 29 times. Bio-liquid and chitosan mixed in different proprotions has synergistic effect,bio-liquid and chitosan EC50solution mixed by 1∶1 ratio has the largest co-toxicity factor.

biomass-liquid;chitosan;Colletotrichumnigrum;antimicrobial effect;compound preservative

2016-11-18

付长雪(1994-)，女，在读硕士研究生，研究方向：农产品贮藏与加工，E-mail：1633078222@qq.com。

*通讯作者:李范洙(1965-)，男，博士，副教授，研究方向：农产品贮藏与加工，E-mail：fzli@ybu.edu.cn。 张先(1963-)，女，博士，副教授,研究方向：农产品贮藏与加工，E-mail：zhangdory@aliyun.com。

吉林省重点科技发展计划项目(20130204045NY)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)13-0286-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.053