褐飞虱两个dynamin-1-like基因的克隆、多克隆抗体制备及 表达定位

赵晨星 俞叶微 许益鹏 俞晓平



褐飞虱两个基因的克隆、多克隆抗体制备及 表达定位

赵晨星 俞叶微 许益鹏 俞晓平*

(中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，杭州310018；*通讯联系人, E-mail: yxp@cjlu.edu.cn)

【目的】研究的两个基因和在褐飞虱中的生物学功能。【方法】通过聚合酶链式反应扩增褐飞虱的两个基因，并对其生物信息学进行分析。通过荧光定量PCR技术(qPCR)检测了这两个基因在褐飞虱不同组织和不同发育阶段中的相对表达量。构建原核表达载体，在表达菌株Rosetta中诱导重组目的蛋白的表达。通过Ni柱亲和层析纯化目的蛋白，并将纯化得到的蛋白免疫新西兰大白兔，得到多克隆抗体，并用ELISA检测抗体效价，Western blotting检测抗体特异性。利用上述抗体，通过免疫荧光实验观察目的蛋白在褐飞虱卵巢中的表达和定位。【结果】克隆并鉴定了两个基因，分别命名为和(GenBank登录号分别为KY082900、KY082901)。系统进化树表明，和在半翅目昆虫中较为保守。蛋白结构预测和基因时空表达分析说明，和在褐飞虱中可能有着不同的功能。ELISA和Western blotting结果表明，制备的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2多克隆抗体效价高、特异性好。免疫荧光实验结果显示，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢滤泡细胞中普遍表达，可能与褐飞虱卵巢发育和成熟有关，它们也可能与类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有关。【结论】获得了和基因序列，了解了其基本的生物信息，并阐明了其时空表达特征；成功制备其多克隆抗体，并初步了解了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢中的表达和定位。这些结果为深入研究NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中的功能奠定了基础。

褐飞虱；；基因克隆；表达模式；原核表达；多克隆抗体；表达定位

褐飞虱(Stål)属于半翅目飞虱科(Hemiptera：Delphacidae)，属远距离迁飞性害虫，给亚洲国家的水稻生产造成极大威胁，严重时可造成水稻绝产[1-3]。褐飞虱通过刺吸式口器吸取水稻汁液为害水稻，并可传播水稻锯齿叶矮缩病和水稻草状矮缩病等病毒病[4,5]。长期以来主要通过喷洒化学农药和种植抗性水稻品种对褐飞虱进行防治，导致褐飞虱对很多农药和抗性水稻品种产生抗性，这对有效控制褐飞虱危害是一个巨大挑战[6-8]。

迁飞性昆虫的迁飞与卵巢发育密不可分，所以研究昆虫生殖发育是研究害虫发生规律及预测预报的重要方向[9,10]。昆虫卵巢的发育依赖于卵黄蛋白原等营养物质的吸收和沉积。有研究表明卵黄蛋白原通过胞吞作用进入卵母细胞，以卵黄素的方式进行沉积，在这过程中涉及ACTIN、CLATHRIN、DYNAMIN等蛋白[11,12]。发动蛋白DYNAMIN在网格蛋白CLATHRIN介导的内吞作用中发挥重要作用[13,14]。在内吞作用过程中，DYNAMIN在交叉蛋白INTERSECTIN的作用下被召集到膜上，吞蛋白ENDOPHILIN和双载蛋白AMPHIPHYSIN使内吞小泡的颈部收缩，促进DYNAMIN围绕颈部聚合形成多聚体。在GTP酶水解GTP产生的能量的作用下，DYNAMIN多聚体发生构象改变，使得内吞小泡的颈部进一步收缩，从而使内吞小泡与质膜分离，DYNAMIN在这个过程中发挥“剪刀”的作用[15-17]。研究表明，DYNAMIN对于哺乳动物脑中突触的传递发挥重要作用，神经元对DYNAMIN 1缺失很敏感并会引起突触内吞作用不正常运作，有多种神经性疾病与DYNAMIN有关[18-20]。DYNAMIN的作用不仅限于内吞作用，还参与多种细胞活动，包括细胞分裂、细胞膜的重排、细胞骨架的调节、微管动态变化、细胞凋亡等[21,22]。

为了解褐飞虱基因的功能，本研究克隆了褐飞虱的两个基因和，制备了多克隆抗体并应用免疫荧光来研究其在褐飞虱卵巢中的表达和定位，以期为深入研究该基因在褐飞虱中的生物学功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

试验褐飞虱为本实验室(浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室)在水稻品种TN1上长期饲养的种群，室内饲养温度(27±1)℃，相对湿度80%，光照周期为14 h光照/10 h黑暗。

1.2 褐飞虱总RNA提取和cDNA第1链的合成

取5头褐飞虱羽化后3d的成虫，用RNA 提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)提取褐飞虱总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳和蛋白核酸定量分析仪(Thermo)检验RNA的完整性和浓度，用于cDNA第1链的合成。

使用反转录试剂盒(PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa公司)将褐飞虱总 RNA反转录成cDNA。

表1 基因克隆、原核表达引物碱基序列

下划线表示酶切位点。

Underline represents restriction enzyme site.

1.3 基因克隆与序列分析

根据褐飞虱转录组数据，得到基因的相关序列。利用Primer Premier 5.0设计引物(表1)，由上海生工生物技术有限公司合成。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒(AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit)进行PCR产物的回收，回收产物连于pMD-19T质粒载体(TaKaRa公司)，转化到感受态细胞JM109(本实验室保存)中，随机挑取10个克隆斑，用表1中基因克隆引物进行PCR筛选阳性克隆，送交上海睿迪生物有限公司进行测序。

利用Clustal X进行多重序列比较后，用MEGA6的邻接法(Neighbor-Joining)制作进化树，自展(bootstrap)值为1000。通过PROSITE网站(http://prosite.expasy.org/)预测蛋白结构域，通过Lasergene Protean软件预测蛋白二级结构，Phyre2在线网站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)模拟蛋白质三级构象。

1.4 基因的时空表达分析

采用荧光定量PCR(qPCR)技术分析目的基因的时空表达。反应体系共25 μL，其中12.5 μL荧光定量PCR检测试剂(SYBR Green Premix Ex酶，TaKaRa)，2 μL模板，上下游引物各1 μL(表1)。将1~5龄若虫和羽化后1~5 d雌成虫作为不同发育时期样品，将雌成虫卵巢、肠道、脂肪体以及其他组织作为不同组织样品，分别提取其RNA，反转录成cDNA。采用2－△△Ct法计算基因的相对表达量，内参基因选用褐飞虱，所有样品设置3个重复。基于Tukey检验，并使用SPSS 18.0进行单因素方差分析。

1.5 原核表达载体的构建

根据得到的序列，设计分别含有HⅠ、dⅢ和RⅠ、dⅢ(TaKaRa公司)酶切位点的特异性引物(表1)，用于构建阳性克隆质粒，通过PCR和双酶切鉴定后，送交上海睿迪生物有限公司测序。

采用生工生物工程有限公司生产的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取测序验证正确的克隆质粒，对提取的质粒进行双酶切，回收基因片段，与同样经过双酶切的表达载体pET-28a(本实验室保存)连接。连接产物转化于大肠杆菌JM-109感受态细胞中，PCR筛选阳性克隆并提取质粒进行酶切分析。选取鉴定结果为阳性的重组质粒送交公司测序确认。

1.6 重组蛋白质的诱导表达

将pET-28a重组表达载体转入大肠杆菌Rosetta (本实验室保存)中，通过青岛高科园海博生物技术有限公司HB-PET自诱导培养基进行诱导表达。蛋白质表达情况采用碧云天生物技术公司生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒进行蛋白电泳分析。离心收集上述诱导的大肠杆菌菌液，经超声破碎(超声功率为70 W，时间10 min，工作5 s，间隔15 s)，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后分析蛋白的表达。

1.7 重组蛋白的纯化

由于采用pET-28a作为表达载体，而所插入的基因片段不包含信号肽编码序列，所以可以利用表达载体pET-28a所带的6×His标签纯化重组蛋白。用8 mol/L尿素变性溶解包涵体，采用纯化树脂(Ni-NTA His·Bind Resin，上海七海复泰生物技术有限公司)亲和层析纯化重组蛋白。收集各部分洗脱液，经SDS-PAGE电泳分析各部分洗脱液。纯化后的蛋白用超滤管(Amicon®ProMerck, Millipore公司)超滤浓缩，得到的蛋白液经过蛋白浓度检测后，干燥成粉末状，－70℃下密封保存。

1.8 重组蛋白的多抗血清制备

用PBS溶解上述融合蛋白的蛋白粉，皮下注射新西兰大白兔4次，首次剂量为500 μg。注射白兔所用的弗氏佐剂购自Sigma公司，第一次免疫前与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，第2~4次使用不完全弗氏佐剂。第一次免疫后每两周加强免疫一次，期间可取少量血清检测效价，直到效价符合实验要求后，于兔颈动脉大量取血，采用离心的方法分离血清，分装后－70℃下保存备用。

1.9 抗体效价检测

采用间接ELISA方法进行抗体效价检测。将纯化蛋白用包被稀释液稀释到1 g/L，依次经过包被、封闭、不同稀释比例的兔抗血清一抗孵育、HRP-羊抗兔IgG二抗孵育，最后加TMB底物显色液，37℃避光放置5 min，加入终止液，20 min内用酶标仪测定450值。HRP-羊抗兔IgG和TMB底物显色液购自Solarbio科技有限公司。

1.10 Western blotting检测目的基因在褐飞虱体内的表达

取3头褐飞虱羽化后3 d的雌成虫，加入100 μL组织细胞快速裂解液(RIPA)和1 μL蛋白酶抑制剂(PMSF)，放入快速研磨振荡器中研磨，在4℃、5000下离心10 min，吸取上清液即是褐飞虱总蛋白。取上清液SDS-PAGE凝胶电泳后，通过湿式转印法将蛋白转到硝酸纤维素膜(NC)上，然后将膜放入封闭液(5%脱脂奶粉)中室温封闭2 h，经TBST洗涤后再加入1∶500稀释的目的蛋白抗血清溶液，4℃下孵育过夜，用TBST洗去未结合的一抗，加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG，室温孵育8 h，用TBST洗涤，最后加入DMB显色液避光显色。组织细胞快速裂解液(RIPA)、蛋白酶抑制剂(PMSF)、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG和DMB显色液购自Solarbio科技有限公司。

1.11 免疫荧光杂交

免疫荧光实验中用到的免疫染色洗涤液、固定液、封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液以及抗荧光淬灭封片液购自碧云天生物技术公司，免疫荧光二抗(Dylight 488, Goat anti Rabbit IgG)购自Abbkine公司。收集雌成虫，在解剖镜下、PBS溶液中解剖获得卵巢，经免疫染色洗涤液洗涤后，加免疫染色固定液于湿盒中，4℃下过夜，洗涤后再加免疫染色封闭液室温封闭2 h，然后依次加入稀释500倍一抗4℃下过夜，稀释500倍的二抗室温避光2 h。用DAPI染料标记细胞核、DiI染料标记卵巢样品中的脂类物质，在Leica(SP8)共聚焦显微镜下根据细胞核和细胞膜的位置判断目的蛋白的亚细胞定位。

2 结果与分析

2.1 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2克隆和序列分析

本研究克隆得到了褐飞虱的两个基因，分别命名为和(GenBank登录号分别为KY082900、KY082901)。的开放阅读框为2073 bp，编码690个氨基酸，预测分子量为77.55 kD，理论等电点为7.12；的开放阅读框为2148 bp，编码715个氨基酸，预测分子量为80.35 kD，理论等电点为6.72(图1)。二者编码蛋白的同源性为66%，差异主要体现在近C端(图1)。

图1 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2氨基酸序列比对

Fig. 1. Amino acid sequence alignments of NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2

图2 NlDNM1L-1(A)和NlDNM1L-2(B)蛋白三级结构预测

Fig. 2. Tertiary structure of NlDNM1L-1(A) and NlDNM1L-2(B) protein.

图3 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2氨基酸序列的系统进化分析

Fig. 3. Phylogenetic analysis of NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2by the neighbor-joining method.

使用Phyre2在线网站对NlDNM1L-1和NlDNM1L-2蛋白三级结构进行预测，结合PROSITE预测的结构域以及Lasergene Protean软件预测的二级结构，推测NlDNM1L-1和NlDNM1L-2都有GTPase结构域、中间结构域(MD)、GTPase效应结构域(GED)和普列克底物蛋白同源结构域(PH) (图2)。预测的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2三级结构较为类似，但PH结构域有所不同。在PH结构域中，NlDNM1L-1只有3个-折叠，而NlDNM1L-2有7个-折叠。

通过NCBI下载与和基因同源的其他半翅目昆虫的dynamin-1-like氨基酸序列以及双翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和哺乳动物、爬行动物等的dynamin-1-like氨基酸序列，用MEGA6的邻接法（Neighbor-Joining）制作进化树。如图3显示，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2与豌豆长管蚜、点蜂缘蝽、柑桔木虱系统发育关系较近，说明NlDNM1L-1、NlDNM1L-2在半翅目中较保守。

图中不同小写字母表示差异达5%显著水平。

Fig. 4. Expression ofandin differenttissues(A, B) and at different developmental stages(C, D)

A－克隆载体的构建。其中，M为DNA标记；泳道1为pMD-19T-NlDNM1L-1重组质粒酶切产物；泳道2为pMD-19T-NlDNM1L-2重组质粒酶切产物。箭头所指为酶切释放的基因片段。B－原核表达载体的构建。其中，M为DNA标记；泳道1为pET-28a-NlDNM1L-1重组质粒酶切产物；泳道2为pET-28a-NlDNM1L-2重组质粒酶切产物。箭头所指为酶切释放的基因片段。

Fig. 5. Construction of cloning vector(A) and prokaryotic expression vector(B and C).

2.2 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2的时空表达分析

荧光定量PCR结果显示，和在褐飞虱不同组织中表达量不同，其中卵巢中表达量最高，脂肪体、肠道的表达量次之(图4-A、B)。和在褐飞虱各个发育阶段均有表达，在若虫和成虫体内表达量虽有上下波动，但总体变化不大；而的表达模式不同，在成虫体内的表达量显著高于若虫，羽化后2 d表达量达到高峰，并在之后维持在高水平(图4-C、D)。

2.3 重组蛋白质的诱导表达与重组表达蛋白纯化

经酶切鉴定和测序验证，成功构建和的重组原核表达载体，pET-28a- NlDNM1L-1和pET-28a-NlDNM1L-2(图5)。将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中，经37℃诱导8 h后表达产物通过SDS-PAGE电泳分析，pET-28a- NlDNM1L-1和pET-28a-NlDNM1L-2诱导产物分别为80 kD和85 kD大小的特异性蛋白条带，而预期融合表达的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2大小应为80 kD和83 kD，这说明目的蛋白被成功诱导表达。经超声破碎发现，表达的蛋白以包涵体的形式存在，上清液中只有少量可溶性蛋白的表达(图6-A)。

A图中，M为蛋白标记；泳道1为空的Rosetta菌株；泳道2为pET-28a/Rosetta；泳道3，4和5分别为pET-28a-NlDNM1L-1/ Rosetta诱导后的表达产物，裂解后的上清液和裂解后的沉淀；泳道6，7和8分别为pET-28a-NlDNM1L-2/Rosetta诱导后的表达产物，裂解后的上清液和裂解后的沉淀。箭头指表达的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2。B和C图分别为NlDNM1L-1、NlDNM1L-2蛋白的纯化。M为蛋白标记；泳道1为经PBS洗涤后的pET-28a-NlDNM1L-1/Rosetta (pET-28a-NlDNM1L-2/Rosetta)裂解后的沉淀；泳道2~6为50、80、100、120、150 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白；泳道7为纯化后的蛋白经超滤所得产物。箭头分别指NlDNM1L-1、NlDNM1L-2蛋白。

Fig. 6. Expression analysis(A) and purification(B and C) of expressed NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 inRosetta by SDS-PAGE.

M－蛋白标记；泳道1－褐飞虱总蛋白中的内源NlDNM1L-1的检测；泳道2－褐飞虱总蛋白中的内源NlDNM1L-2的检测。箭头所指用制备的NlDNM1L-1、NlDNM1L-2多克隆抗体检测到的NlDNM1L-1、NlDNM1L-2蛋白条带。

Fig. 7. Western blotting analysis of polycolonal antibodies.

融合有6×His的NlDNM1L-1、NlDNM1L-2重组蛋白的包涵体经过PBS反复洗涤后，用8 mol/L尿素变性溶解，在Ni-NTA柱亲和层析过程中采用10~200 mmol/L咪唑的梯度洗脱，结果显示在50 mmol/L咪唑洗脱下开始出现单一的蛋白。洗脱收集的蛋白经超滤浓缩后，SDS-PAGE结果显示，重组蛋白的纯度达90%以上(图6-B、C)。

2.4 抗血清的制备及Western blotting检测

血清抗体的效价ELISA检测表明，NlDNM1L-1、NlDNM1L-2抗血清效价可达1∶100 000。为检测所得抗体的特异性，提取褐飞虱总蛋白为抗原，NlDNM1L-1、NlDNM1L-2抗血清(1∶500)为一抗抗体，进行Western blotting检测。结果表明，NlDNM1L-1、NlDNM1L-2抗血清分别能在80 kD和85 kD左右杂交得到一条特异性的条带(图7)，与预期蛋白80 kD和83 kD一致，说明所制备的抗体特异性良好，可以与内源性的NlDNM1L-1、NlDNM1L-2结合。

2.5 NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢中的表达和定位

NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢中的免疫荧光实验表明(图8)，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在卵巢管中普遍存在，主要存在于滤泡细胞的细胞质中，在细胞核内则少量分布，在胞外分布很少(图8-B、E、H、K)。与红色信号的脂类物质定位相比，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2与之定位较为一致(图8)。同时，也可以发现，正在侵入卵巢的类酵母共生菌(yeast-like symbiont, YLS)周围也有绿色信号(图8-E、K)，说明NlDNM1L-1和NlDNM1L-2与YLS共定位。

DAPI染料在紫外激光下显示蓝色，DiI染料在552nm激光下显示红色，免疫荧光二抗在488 nm激光下显示绿色。Pe、TO、PO、Tr、Oo、FC、EP和YLS分别代表卵巢柄、倒一卵母细胞、倒二卵母细胞、滋养区、卵母细胞、滤泡细胞、上皮栓和类酵母共生菌。

DAPI shows blue under UV laser. DiI shows red under 552nm laser. Fluorescent secondary antibody shows green under 488 nm laser. Pe, TO, PO, Tr, Oo, FC, EP and YLS represent petiole of ovariole, terminal oocyte, penultimate oocyte, tropharium of ovariole, oocyte, follicle cell, epithelial plug and yeast-like symbiont, respectively.

图8 免疫荧光检测NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢中的表达

Fig. 8. Expression analysis of NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 inovary by immunofluorescence.

3 讨论

Dynamin是细胞骨架蛋白的成员，与胞吞胞吐作用有关。经典的Dynamin蛋白GTP酶结构域结合和水解GTP，参与能量代谢；PRD结构域即富含脯氨酸结构域，与胞吞作用中另外三种蛋白交叉蛋白、吞蛋白(Endophilin)和双载蛋白(Amphiphysin)的SH3结构域结合；MD、GED结构域，参与自身聚合与GTP酶活性的调节；还有一个位于MD和GED之间的可变区域，在dynamin 1中它是PH结构域，能结合磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸，刺激GTP酶活性,促进囊泡的形成[17,23]。本研究中NlDNM1L-1 、NlDNM1L-2是Dynamin-1-like蛋白的亚型，它们没有PRD结构域，二级结构大致相同，预测的三级结构中基本结构类似，在PH结构域中有较大的差异，二者可能在囊泡的锚定和剪切、脂类物质的传导方面功能有所不同[17,24]。这两个基因在褐飞虱不同发育时期的表达模式分析表明，在褐飞虱各发育时期表达相对稳定，而在褐飞虱成虫期起着更为重要的作用。这些结果说明，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2可能在褐飞虱中发挥不同的功能。

本研究发现，和在褐飞虱成虫卵巢中大量表达，而免疫荧光定量结果显示，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2与卵巢中的脂类物质定位一致，这说明，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢的发育和成熟中可能起着重要作用。有研究指出，dynamin在果蝇卵巢上皮细胞管腺增生过程中是必需的，参与管道关闭、细胞嵌入、顶端扩张等过程[22]，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2是否通过上述过程调控卵巢吸收脂类物质需进一步研究。前人研究显示，动力样蛋白(dynamin-like protein)和动力相关蛋白(dynamin related protein)大部分定位在胞质、线粒体、高尔基体等亚细胞结构中[25,26]，本研究结果与之一致。同时，本研究还发现，NlDNM1L-1和NlDNM1L-2也与正在入侵褐飞虱卵巢的类酵母共生菌(YLS)共定位。有研究表明，褐飞虱体内类酵母共生菌进入卵母细胞的过程受ACTIN调控，ACTIN参与了类酵母共生菌进入卵母细胞的大部分过程[27,28]，那么同样作为细胞骨架蛋白的Dynamin，也可能参与褐飞虱体内类酵母共生菌的入卵过程。

抗体是研究蛋白质功能的重要工具，为深入研究NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中的功能，本研究制备了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2多克隆抗体。在制备过程中，目的蛋白主要以包涵体的形式存在于大肠杆菌细胞裂解液的沉淀中，并没有大量出现在上清液中，这种现象有很多原因，比如诱导时间、pH、蛋白的折叠机制等[29]，我们改变条件发现目的蛋白仍存在于包涵体中，所以先使用尿素溶解包涵体再纯化蛋白。我们发现与使用LB培养基加入IPTG诱导相比，使用新型的HB-PET自诱导培养基得到相对更多蛋白。本研究中，目的蛋白与6×His融合表达，相对于GST融合表达来说，在纯化条件选择时，无需顾及蛋白质变性与否，对于包涵体中蛋白的纯化较为容易。通过调整洗脱Ni柱的咪唑浓度，本研究成功获得了纯度较高的融合蛋白，为成功获得多克隆抗体奠定了基础。

综上所述，本研究成功克隆了褐飞虱的两个基因，并进行生物信息学分析，通过利用成功制备得到的多克隆抗体，我们研究了褐飞虱NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢的表达和定位，为今后深入研究这两个蛋白在褐飞虱卵巢发育和生殖中的功能奠定了分子基础。

[1] 程遐年, 吴进才, 马飞. 褐飞虱研究与防治. 北京: 中国农业出版社, 2003: 53-62.

Cheng X N, Wu J C, Ma F. Brown Planthopper: Occurrence and Control. Beijing: China Agriculture Press, 2003: 53-62. (in Chinese)

[2] 荆胜利, 何光存, 江磊, 李刚, 刘虹, 陈雁, 覃瑞. 褐飞虱致害性研究进展. 植物学研究, 2013, 2(1): 6-12.

Jing S L, He G C, Jiang L, Li G, Liu H, Chen Y, Qin R. Advancement in studies on the virulent of brown planthopper., 2013, 2(1): 6-12. (in Chinese with English abstract)

[3] Sun L H, Wang C M, Su C C, Liu Y Q, Zhai H Q, Wan J M. Mapping and marker-assisted selection of a brown planthopper resistancegene in rice (L.)., 2006, 33(8): 717-723.

[4] Wang H, Xu D L, Pu L L, Zhou G H. Southern rice black-streaked dwarf virus alters insect vectors' host orientation preferences to enhance spread and increase rice ragged stunt virus co-infection., 2014, 104(2): 196-201.

[5] Wang W X, Lai F X, Li K L, Fu Q. Selection of reference genes for gene expression analysis inwith different levels of virulence on rice by quantitative real-time PCR., 2014, 21(6): 305-311.

[6] 邓飞, 倪深, 陈红旗, 王跃星, 胡国文, 王孔俭, 李素佳, 朱旭东. 水稻改良品系对褐飞虱和白背飞虱的抗性评价. 中国农学通报, 2016, 32(3): 16-21.

Deng F, Ni S, Chen H Q, Wang Y X, Hu G W, Wang K J, Li S J, Zhu X D. Resistance evaluation of rice improved lines to brown planthopper and white-backed planthopper., 2016, 32(3): 16-21. (in Chinese with English abstract)

[7] Hu J, Xiao C, He Y Q. Recent progress on the genetics and molecular breeding of brown planthopper resistance in rice., 2016, 9(1): 30-41.

[8] Mu X C, Zhang W, Wang L X, Zhang S, Zhang K, Gao C F, Wu S F. Resistance monitoring and cross-resistance patterns of three rice planthoppers,,andto dinotefuran in China., 2016, 134: 8-13.

[9] Qi H, Jiang C, Zhang Y, Yang X, Cheng D. Radar observations of the seasonal migration of brown planthopper (Stål) in Southern China., 2014, 104(6): 731-741.

[10] Chapman J W, Reynolds D R, Wilson K. Long-range seasonal migration in insects: mechanisms, evolutionary drivers and ecological consequences., 2015, 18(3): 287-302.

[11] Richard D S, Gilbert M, Crum B, Hollinshead D M,Schelble S, Scheswohl D. Yolk protein endocytosis by oocytes in: Immunofluorescent localization of clathrin, adaptin and the yolk protein receptor., 2001, 47(7): 715-723.

[12] Ronnau M, Azevedo D O, Fialho M C Q, Gonçlaves W G, Zanuncio J C, Serrão J E. Changes in follicular cells architecture during vitellogenin transport in the ovary of social Hymenoptera., 2016, 253(3): 815-820.

[13] McMahon H T, Boucrot E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis., 2011, 12(8):517-533.

[14] Schmid S L, Frolov V A. Dynamin: Functional design of a membrane fission catalyst., 2011, 27(1): 79-105.

[15] Praefcke G J K, McMahon H T. The dynamin superfamily: universal membrane tubulation and fission molecules?, 2004, 5(2): 133-147.

[16] Ford M G J, Jenni S, Nunnari J. The crystal structure of dynamin., 2011, 477(7366): 561-566.

[17] Sundborger A C, Hinshaw J E. Regulating dynamin dynamics during endocytosis., 2014, 6:85-93.

[18] Ferguson S M, Brasnjo G, Hayashi M, Wölfel M, Collesi C, Giovedi S, Raimondi A, Gong LW, Ariel P, Paradise S, O'Toole E, Flavell R, Cremona O, Miesenböck G, Ryan T A, De Camilli P. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis.2007, 316(5824): 570-574.

[19] Hayashi M, Raimondi A, O'Toole E, Paradise S, Collesi C,Cremona O, Ferguson S M, De Camilli P. Cell- and stimulus-dependent heterogeneity of synaptic vesicle endocytic recycling mechanisms revealed by studies of dynamin 1-null neurons., 2008, 105(6): 2175-2180.

[20] Fan F, Funk L, Lou X L. Dynamin1- and 3- mediated endocytosis is essential for the development of a large central synapse, 2016, 36(22): 6097-6115.

[21] Sever S, Chang J, Gu C. Dynamin rings: Not just for fission., 2013, 14(12): 1194-1199.

[22] Peters N C, Berg C A. Dynamin-mediated endocytosis is required for tube closure, cell intercalation, and biased apical expansion during epithelial tubulogenesis in theovary., 2016, 409(1): 39-54.

[23] Takei K, Yoshida Y, Yamada H. Regulatory mechanisms of dynamin-dependent endocytosis., 2005, 137(3): 243-247.

[24] Achiriloaie M, Barylko B, Albanesi JP. Essential role of the dynamin pleckstrin homology domain in receptor- mediated endocytosis., 1999, 19(2): 1410-1415.

[25] Li X L, Gould S J. The dynamin-like GTPase DLP1 is essential for peroxisome division and is recruited to peroxisomes in part by PEX11., 2003, 278(19): 17012-17020.

[26] Wang Z G, Jiang H, Chen S, Du F H, Wang X D. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways., 2012, 148(1-2): 228-243.

[27] Yukuhiro F, Miyoshi T, Noda H. Actin-mediated transovarial transmission of a yeastlike symbiont in the brown planthopper., 2014, 60: 111-117.

[28] Nan G H, Xu Y P, Yu Y W, Zhao C X, Zhang C X, Yu X P. Oocyte vitellogenesis triggers the entry of yeast-like symbionts into the oocyte of brown planthopper (Hemiptera: Delphacidae)., 2016, 109(5): 753-758.

[29] Rosano G L, Ceccarelli E A. Recombinant protein expression in: Advances and challenges.,2014, 5(172): 1-17.

Gene Cloning, Polyclonal Antibody Preparation and Expression Localization of TwoGenes from(Hemiptera: Delphacidae)

ZHAO Chenxing, YU Yewei, XU Yipeng, YU Xiaoping*

(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine, College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China;*Corresponding author, E-mail: yxp@cjlu.edu.cn)

【Objective】To study the biological function of twogenes,andin,【Method】twogenes were cloned fromby polymerase chain reaction (PCR), and their bioinformatics analysis was conducted.Using fluorescence quantitative real-time PCR technology, the relative expression levels ofandin different tissues and at different developmental stages ofwere detected.The expression vectors of the two genes were constructed and recombinant proteins were expressed inRosetta. The expressed recombinant proteins were purified by Ni-NTA agarose gel affinity system and then injected into New Zealand white rabbit to generate polyclonal antibodies. The titer of the antibodies was monitored by ELISA, and the immune specificity was determined by Western blotting hybridization. Using above antibodies, the localization of target proteins in ovary was detected by immunofluorescence. 【Result】The twogenes were cloned, and their GenBank accession numbers were KY082900 and KY082901, respectively. The phylogenetic tree showed that NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 were conserved in Hemipterans. The results of protein structure prediction and space-time expression pattern analysis indicated that NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 might play different roles in. The ELISA and Western blotting results showed that the polyclonal antibodies had high titer and good specificity. Immunofluorescence showed that NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 were widely distributed in the follicle cells ofovary, indicating that they may be related to the development and maturity ofovary. NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 may also be associated with the invasion of the yeast-likesymbiontstoovary. 【Conclusion】The DNA sequences, bioinformatics and expression pattern ofandwere clarified. Andthepolyclonal antibodiesof NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 were obtained and their localizations in the ovary have preliminarily been understood. These results lay a foundation for further biological function investigation of NlDNM1L-1 and NlDNM1L-2 in

;; gene cloning; expression pattern; prokaryotic expression; polyclonal antibody; localization

10.16819/j.1001-7216.2017.6165

Q755; S435.112+.3

A

1001-7216（2017）04-0345-10

2016-12-12;

国家自然科学基金资助项目(31501632)；浙江省自然科学基金资助项目(LQ14C140006)；国家973计划资助项目(2012CB114105)。

修改稿收到日期：2017-03-22。