不同发酵类型乳酸菌对低水分粳稻秸秆青贮发酵 品质及有氧稳定性的影响

司华哲， 刘晗璐， 南韦肖,2， 金春爱， 李光玉*

(1.中国农业科学院特产研究所，吉林，长春 130112； 2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林，长春130118)

我国是产粮大国，农副秸秆资源丰富。稻米作为我国主要粮食种类，全国种植量大，但由于对秸秆综合利用不足导致大量秸秆被堆放在田间后随意焚烧，对空气造成了严重污染。据文献记载，稻秸年产量约为1.89亿吨，其中我国主要粮食种植区之一的东北地区稻秸产量为3149.15万吨，占全国总量的14.18%[1]。自然风干后的稻秸是一种劣质的粗饲料，刈割后的粳稻秸秆水分含量低，适口性差，干物质的消化率低，即使反刍动物瘤胃微生物也很难加以分解利用，这也是制约稻秸作为动物粗饲料的主要因素，而经过加工处理后的秸秆，可提高反刍动物的采食量和消化率[2]。

秸秆饲料的加工方式主要有物理、化学和生物处理3种，其中物理法仅停留在长度、粗细等物理状态的改变而不能增加饲料的营养价值，化学处理法通常为碱化、氨化或酸化处理，其加工费用较高且处理液处置不当易造成环境污染，生物法因其可较好的保留秸秆营养价值且延长其保存时间等优点已在我国畜牧生产中普遍推广使用[3]。低水分青贮为特殊青贮的方法之一，适用原料来源更加广泛，同时克服原料水分不足的缺点，因而适用于东北刈割脱粒后的粳稻秸秆。

低水分青贮通常使用外源添加剂促进青贮过程，其中外源添加乳酸菌可克服原料本身附着乳酸菌少和缓冲能高等缺点，加速青贮过程，提高发酵品质[4]。不同发酵类型乳酸菌发酵终产物不同，其中同型发酵乳酸菌可提高青贮的乳酸含量，降低pH值，极大的提高青贮质量，而异型发酵乳酸菌可分解利用乳酸生成乙醇和乙酸，前者有一定的杀菌作用，后者则可抑制真菌的繁殖，这对青贮过程中有害细菌的减少及开窖后有氧稳定性的提高均有促进作用。Guo等研究发现，添加同型发酵乳酸菌青贮可提高青贮牛尾草的干物质、粗蛋白和乳酸生成量[5]。Kleinschmit等研究发现，在牧草、玉米与谷类秸秆青贮过程中添加异型发酵乳酸菌，可以降低青贮的pH，提高乳酸含量，并提高青贮的有氧稳定性[6]。因此，本试验采用从吉林地区青贮状况良好的玉米青贮饲料中分离得到的同型发酵乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillusplantraum)S2406和异型发酵乳酸菌布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)H4001应用于低水分青贮稻秸，监测其发酵后营养物质的变化，研究上述两株乳酸菌对稻秸发酵品质的影响，为更科学有效地利用分离得到的优良乳酸菌及改善稻秸发酵品质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验用菌种来源于本实验室自主分离、鉴定、保存的布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)H4001及植物乳杆菌(Lactobacillusplantraum)S2406，使用MRS乳酸细菌液体培养基，37℃培养24 h，培养液中含活菌数约为1×1010cfu·mL-1，作为试验用菌株。以吉林省双阳区种植粳稻副产品稻秸为低水分青贮材料。使用直径8 cm，高20 cm，壁厚0.1 cm，容积为1 L的螺口树脂瓶作为青贮容器。

试验根据添加物质不同。分为4个处理组：1组喷洒等量的无菌水(CS)；2组喷洒布氏乳杆菌H4001(HS)，添加量为5×106cfu·g-1FM；3组喷洒植物乳杆菌S2406组(SS)，添加量为5×106cfu·g-1FM；4组喷洒植物乳杆菌与布氏乳杆菌混合菌液(MS)，添加量为(2.5+2.5)×106cfu·g-1FM。

1.2 低水分青贮制作

2016年10月7日，将刈割脱粒后的粳稻秸秆切碎至1～1.5 cm长短，将植物乳杆菌S2406与布氏乳杆菌H4001新鲜培养液使用无菌去离子水稀释后，使用喷壶均匀喷洒于稻秸上，喷洒量为5×106cfu·g-1FM，取950～1 000 g快速压实填紧于容积1 L的树脂瓶中；对照组，喷洒等量的无菌水。制作结束后，青贮瓶室温保存，定期检查瓶口封闭状态，如有松动及时旋紧瓶盖。室温发酵，试验期60天。

1.3 样品采集与分析

取粳稻秸秆500 g，每组3个重复，放入鼓风干燥箱内，65℃下烘干48 h，测定含水量，粗蛋白质(crude protein, CP)，粗脂肪(ether extract, EE)可溶性碳水化合物(water soluable carbohydrate, WSC)，中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)，酸性洗涤纤维(acid detergent fibre, ADF)和灰分(Ash)含量。

60 d后取样品30 g，放入500 mL锥形瓶中，加入270 mL无菌蒸馏水，搅拌均匀后静置2 h，将混有样品的蒸馏水用搅拌器(方成 SG260-B，中国)搅拌10 min，搅拌液经4层纱布过滤，测定该滤液的pH值，挥发性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)，乙醇(ethanol, ETH)，乳酸(lactic acid, LA)，氨态氮(ammoniacal nitrogen, NH3-N)含量。另取青贮样品400 g进行营养物质的测定，检测干物质(dry matter, DM)、CP、EE、WSC、ADF、NDF和Ash含量。

1.4 测定方法

水分、CP、NDF、ADF采用饲料检测技术测定[7]；WSC的测定采用蒽酮比色法进行测定；粗灰分采用灼烧法测定；pH值使用精密pH测试仪测定；NH3-N含量采用蒸馏法测定；乳酸、乙醇和挥发性脂肪酸含量使用气相色谱仪测定。60天后，将暴露在空气中的青贮瓶置于相同条件下环境中，周围环境保持24℃恒温，使用针式食品温度计在样本正中插入约10 cm深，保持敞口。每隔12 h记录一次样本核心温度，当样本的温度超过室温2℃时作为判定标准[8]。

1.5 数据分析

试验数据使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，均值采用Duncan氏进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌添加剂粳稻秸秆发酵pH值的影响

发酵60 d后，CS、HS、SS和MS的pH值如表1所示。各处理组间差异显著(P<0.05)，其中，乳酸菌添加组pH均低于4.0，分别为HS>MS>SS，而CS的pH值显著高于其他3组，这表明，添加乳酸菌具有降低青贮pH值的效果，单独添加植物乳杆菌对青贮pH下降更有利。

表1 青贮后各组pH值Table 1 The pH valve after silage fermentation

注：表中同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

Note：Different letters in the same row indicate significant differenc at the 0.05 level

SS组乳酸生成量大于其他三组但差异不显著，HS的乙酸和乙醇生成量均显著大于其他3组(P<0.05)(表2)，3个处理组戊酸、丁酸含量均显著小于对照组(P<0.05),且互相之间差异不显著，丙酸的生成量为CS>MS>SS>HS。表明添加布氏乳杆菌可以提高低水分青贮乙酸和乙醇的产生，减少丙酸、丁酸和戊酸的生成。植物乳杆菌可以提高乳酸的生成量。添加乳酸菌后，可以减少青贮的丙酸、丁酸和戊酸的生成量。

表2 青贮中乳酸、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量Table 2 Contents of lactic, ethanol, acetic, propionic acids, butyric acids and valeric acids/μmol·g-1 FM

注：表中同列不同小写字母表示数值差异显著(P<0.05)

Note：Different in the same column letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.3 添加乳酸菌对粳稻秸秆发酵前后营养成分的影响

发酵60 d后，CS、MS、SS和HS同青贮前相比各营养成分均有不同程度的变化(表3)。对比原料，4个处理组的CP、WSC、ADF、EE和Ash的含量显著降低(P<0.05)，而青贮前DM含量与SS组差异不显著但显著高于其他3组(P<0.05)。

青贮原料含水量以及蛋白含量较低，但其可溶性糖含量较高，可用于青贮。青贮后，处理组与对照组相比，DM、CP、WSC含量上均有显著提高(P<0.05)，氨态氮含量显著降低(P<0.05)，NDF、ADF、EE和Ash含量无显著差异。其中，SS组DM、CP含量，HS组的WSC和ADF含量均显著高于其他处理组(P<0.05)。这表明，添加植物乳杆菌可以降低青贮干物质和粗蛋白的损耗，而添加布氏乳杆菌可以提高青贮的WSC含量。

2.4 添加乳酸菌对粳稻秸秆发酵有氧稳定性的影响

4组的有氧稳定性时间分别为：CS组56 h，SS组92 h，HS组121 h，MS组100 h。与CS组相比，SS、HS和MS组的有氧稳定性分别延长了36 h、65 h和44 h，即分别提高了64%、116%和78%。由表4可知，添加植物乳杆菌也可以提高青贮的有氧稳定性，但添加布氏乳杆菌对提高青贮的有氧稳定性效果更佳。

表3 青贮前后营养物质变化Table 3 Chemical composition of the silages

注：表中同列不同小写字母表示数值差异显著(P<0.05)

Note：Different letters in the same column indicate significant differnce at the 0.05 level

表4 青贮有氧稳定性结果Table 4 Aerobic stability of silage exposed to air/h

3 讨论

3.1 不同乳酸菌添加剂对粳稻秸秆发酵pH值、有机酸及挥发性脂肪酸含量的影响

乳酸菌添加剂对青贮发酵品质的影响主要表现在两个方面：一是加快发酵速度，二是改变发酵终产物的含量[9]。本试验中植物乳杆菌组乳酸含量显著低于其他3组，而布氏乳杆菌组乙醇、乙酸生成量显著高于其他3组，这与Weinters和Muck的研究结果一致，同型发酵乳酸菌发酵终产物为乳酸，而异型发酵乳酸菌在厌氧条件下将乳酸分解成乙酸、1,2-丙二醇、CO2和乙醇[10-11]。混合组的乳酸含量低于植物乳杆菌组但高于布氏乳杆菌添加组，其乙醇和乙酸含量则表现出相反结果，这表明混合添加不同发酵类型乳酸菌，可有效提高低水分青贮稻秸乳酸和乙酸生成量。

丁酸的发酵程度是鉴定青贮饲料好坏的重要指标，丁酸含量越多，青贮料品质越差。本试验中，处理组丙酸、丁酸、戊酸生成量均显著低于对照组，这是因为外源乳酸菌添加活性强，且压实的青贮提供了乳酸菌繁殖所需的厌氧环境，其大量繁殖生成乳酸，降低了青贮的pH值，酸性环境与厌氧环境抑制了其他细菌的繁殖及对青贮DM和CP等营养物质的损耗，从而提高了青贮的发酵品质[12]。而对照组青贮pH值、丙酸、丁酸和戊酸显著高于其他处理组，这可能是因为水稻本身附着的乳酸菌数量少，且稻秸中空，压实后仍有少量空气存在，延缓了形成厌氧环境的时间，使乳酸菌无法快速繁殖产酸，并降低青贮的pH值，从而使产丙酸、丁酸和戊酸的好氧细菌，如丁酸菌等活动并大量繁殖，将葡萄糖和乳酸分解成丙酸、丁酸和戊酸等，降低青贮饲料的品质。反刍动物虽然可以直接利用挥发性脂肪酸供能，但由于其易挥发的特点，在开窖到饲喂过程中，可能有大量挥发性脂肪酸损失。本试验中，60 d后乳酸含量偏低，乙酸含量较高。可能是由于原料本身附着乳酸菌多为异型发酵乳酸菌[13]，在青贮后期，分解乳酸生成乙酸导致的，其真正原因仍需进一步研究。因此，在稻秸青贮过程中，应额外添加乳酸菌或碳水化合物以便提高其发酵品质，降低营养物质的损耗。

3.2 不同乳酸菌添加剂对粳稻秸秆发酵营养成分的影响

青贮后稻秸的营养物质对比青贮前均有一定程度的下降，这是由青贮过程中微生物的利用导致的。乳酸菌处理组与对照组相比，DM、CP、ADF和WSC的含量均有显著提高，这与Vaitiekunas与Francisco等人的试验结果一致[14,15]。添加乳酸菌可以加快发酵速度，减少其他细菌繁殖对青贮营养物质的消耗，其中添加植物乳杆菌后青贮的DM和CP含量提高效果显著高于布氏乳杆菌，这可能是因为布氏乳杆菌作为异型发酵乳酸菌发酵的终产物不同引起的。当青贮中乳酸过高时，布氏乳杆菌可分解乳酸，导致青贮的pH值上升，降低了对其他细菌的抑制能力，对青贮DM和CP的保留能力较植物乳杆菌减弱，但在试验过程中发现布氏乳杆菌组WSC和ADF含量显著高于植物乳杆菌，这与Kung的研究结果并不一致[16]，原因可能是微生物繁殖需利用青贮中的WSC作为发酵底物，而异型发酵乳酸菌在实际青贮过程中繁殖速度和数量少于植物乳杆菌，植物乳杆菌大量繁殖的同时加大了对青贮WSC消耗[17]。布氏乳杆菌分解乳酸生成乙醇和乙酸，乙醇有杀菌作用，且乙酸可以抑制一些真菌繁殖，加之布氏乳杆菌繁殖速度弱于植物乳杆菌，因此青贮的WSC含量高于其他组。试验中对照组和植物乳酸菌处理组ADF含量显著低于原料，可能是由于青贮过程中水稻秸秆中纤维素被微生物降解利用后生成半纤维素导致的，半纤维素含量的增高导致了酸性洗涤可溶物的增加，减少了ADF的含量，而HS与MS可能由于其乙酸乙醇含量高于其他组抑制了纤维素降解菌的繁殖[18]。NH3-N含量与青贮CP含量密切相关，其由腐败微生物消耗CP产生[19]。本试验中，植物乳杆菌组CP含量显著高于其他组，其NH3-N含量显著低于其他组。青贮后各组粗脂肪含量显著低于原料，原因可能是霉菌等微生物大量生长，从而分解消耗粗脂肪[20]。混合组在青贮过程中，综合了两种乳酸菌对提高营养物质的优点，虽在各项指标中均未显著高于其他3组，但显著性均介于两者之间。这表明，单独或混合使用不同发酵类型乳酸菌可获得不同的发酵品质，针对不同情况，可以自由选择添加。通过以上试验结果可以说明，适量使用乳酸菌添加剂可有效提高水稻秸秆的发酵品质，减少营养物质损耗。

3.3 添加乳酸菌对粳稻秸秆发酵有氧稳定性的影响

青贮的有氧稳定性定义为青贮饲料在空气中暴露后其内部温度比外界温度高出2℃所需要的小时数[8]。前人研究发现异型发酵乳酸菌可影响青贮有氧稳定性，但延长的时间并无统一定论。Danna通过对比多种影响青贮有氧稳定性的化学物质时发现，乙酸可大幅度提高青贮的有氧稳定性[21]。本试验中，布氏乳杆菌组乙酸生成量显著高于其他组，并且其有氧稳定性时间最长，比对照组延长了65 h，这可以说明乙酸生成量与有氧稳定性成正比。目前同型发酵乳酸菌对有氧稳定性提高的报道很少。而在本试验中植物乳杆菌处理组的有氧稳定性较对照组提高了36 h，这可能是因为乳酸菌具有较强的耐酸作用，当pH下降到4时，其他细菌受抑制活性下降，而其中的异型发酵乳酸菌可在酸性环境利用乳酸。在青贮后期，即使未添加布氏乳杆菌的处理组，如果青贮原料生长环境中存在该菌，则青贮后会存在一定比例的布氏乳杆菌，而同型发酵乳酸菌对青贮有氧稳定性的提高仍是由其中布氏乳杆菌存在导致的[16]。混合组的有氧稳定性时间较对照组提高了44 h，这表明混合添加不同发酵类型乳酸菌在青贮粳稻秸秆开窖后对有氧稳定性有延长作用。

4 结论

本试验中，添加不同发酵类型乳酸菌对粳稻秸秆发酵品质提高效果不同，针对生产实际情况，建议单独或混合添加两种发酵类型乳酸菌，发挥不同组合的优势，解决实际生产中不同问题。乳酸菌处理后的粳稻秸秆，不仅对秸秆资源的合理利用起到重要作用，而且可以缓解北方地区冬春季青饲料缺乏的问题。在未来的研究中，仍需进一步通过试验评价使用添加剂青贮低水分粳稻秸秆对动物生产性能的影响。