胰岛素抵抗HepG2细胞的IGF2BP2基因表达水平

罗琼++卫兴国++曹莹++刘佳

摘 要：目的：研究胰岛素抵抗的HepG2细胞的IGF2BP2基因表达的情况。方法：以不同浓度胰岛素刺激产生有胰岛素抵抗的HepG2细胞，提取各组细胞mRNA，反转录得到cDNA，以Real-Time PCR方法测定目的基因的表达量。结果：胰岛素高、中浓度组的细胞外液葡萄糖浓度明显高于正常组（P<0.05），胰岛素抵抗现象最为显著的中浓度组的IGF2BP2基因表达量显著增加（P<0.01）。结论：胰岛素抵抗明显的HepG2细胞的IGF2BP2基因表达量同步增加，IGF2BP2表达可能与胰岛素抵抗现象有关。

关键词：IGF2BP2基因；胰岛素抵抗；HepG2细胞

中图分类号：R363 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）12-0195-02

2型糖尿病的产生，主要归因为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能紊乱。胰岛素抵抗现象，是由于肌肉细胞、肝细胞和脂肪细胞的胰岛素受体对胰岛素敏感性下降，即正常浓度的胰岛素不能促进血糖利用而导致。体外建立的胰岛素抵抗细胞模型，是利用不同药物直接诱导组织细胞，使组织细胞对胰岛素敏感性降低，葡萄糖吸收量减少，产生胰岛素抵抗。这种胰岛素抵抗细胞模型可直观的研究胰岛素抵抗的发生机制，消除环境因素的影响，非常方便。胰岛素抵抗产生的主要器官是肝脏、肌肉和脂肪组织，因此，体外建立胰岛素抵抗细胞模型的常用细胞有HepG2人肝癌细胞等[1]。

IGF2BP2（胰岛素样生长因子2结合蛋白2）基因在不同型糖尿病患者中的表达具有特异性。前期在不同型糖尿病的患者和正常人中，我们对IGF2BP2基因的表达量进行测定，发现IGF2BP2基因表达量水平与胰岛素水平无直接联系，但是与胰岛素抵抗现象可能存在联系。然而，临床患者在进行基因检验时无法排除环境因素对2型糖尿病产生的影响[2]，课题组拟用可排除环境因素影响的胰岛素抵抗的HepG2细胞，进一步探索IGF2BP2基因表达和胰岛素抵抗现象的联系。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

PCR产物纯化试剂盒、Trizol Reagent、RNase、Oligo dT（Invitrogen公司产品）；Power SYBR Green PCR Master Mix、Taqman Universal PCR Master Mix试剂盒（ABI公司产品）；Sensiscript RT试剂盒（QIAGEN公司产品）；其余反应中所用试剂均为分析纯。实时荧光定量PCR仪（ABI公司产品）。HepG2细胞株为中南大学秦志勇教授惠赠。

1.2 引物和探针设计

引物为5-CACCGGAAGCCCAGTTCAA-3和 5-CCACCTTTGCCAATCACCC-3；探针序列为5-TGAAGCTGGAAGCGCATATCAGAG-3。引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 胰岛素抵抗HepG2细胞模型的建立

按照金水华的研究方式建立胰岛素抵抗细胞模型[3]：HepG2细胞在含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基中，于37℃、5%CO2条件下连续培养。长满瓶底后，用PBS洗2次，胰蛋白酶消化后，按1：3比例传代培养。

将处于对数生长期的细胞消化后，用含2%胎牛血清的高糖DMEM培养基调整细胞密度为1×106/L，移入24孔细胞培养板中继续培养。待细胞长至80%后，胰岛素抵抗细胞模型各组换成含胰岛素浓度为10-5、10-6、10-7mol/L的培养基，为胰岛素高、中、低浓度组，对照组为常规培养基。培养72h后，用葡萄糖氧化酶法测定细胞培养上清液中葡萄糖含量。计算对照组与不同胰岛素浓度组细胞的葡萄糖含量消耗差值，达到胰岛素抵抗最高状态的胰岛素作用浓度为胰岛素最佳浓度。

1.4 细胞总RNA提取、cDNA合成

每组吸取细胞外液测糖时，分别收获106个细胞，按Trizol试剂说明书要求，提取总RNA，提取的RNA浓度经紫外分光光度仪测定，确定OD260/280在1.8～2.0之间，后-80℃保存。取2μg总RNA和Sensiscript RT 试剂盒的试剂进行反应；将反应体系置于37℃孵化60min，cDNA产物-20℃保存待用。

1.5 样本中基因表达量的检测

以样本总cDNA作为模板，按照Taqman Universal PCR Master Mix试剂盒操作，在ABI Prism 7300实时荧光PCR仪中进行反应，测定样本中目的基因的表达量。通过梯度稀释和Real-Time PCR构建基因定量的标准曲线，对样本中的基因表达量进行定量。每次测定时，待测基因均与管家基因GAPDH同时进行反应，作为内参。

1.6 数据分析

本课题中，以IGF2BP2基因的表达量/GAPDH的表达量作为目的基因的表达量。在四组之间，两两采用T-test进行数据比较和分析，采用P值是否小于0.05用以判断各组之间是否存在显著性差异。

2 结果

与正常对照组比较，胰岛素高、中浓度组的细胞外液葡萄糖值显著高于正常组（P<0.05），中等浓度10-6mol/L的胰岛素刺激下，HepG2细胞外液葡萄糖浓度最高（相对正常组P<0.01），提示该组细胞对葡萄糖利用最差，胰岛素抵抗最为显著。使用实时荧光定量PCR的方法测定IGF2BP2基因在各组样本的表达量，并使用管家基因GAPDH进行校正，胰岛素高、中浓度组的IGF2BP2基因相对表达量显著高于对照组（P<0.01），胰岛素低浓度组未见该基因表达量增高。综合两组数据，可以看出胰岛素抵抗现象最为显著的中浓度组的IGF2BP2基因表达量显著增加，推测两者可能具有相关性。如表1所示。

3 讨论

肝脏是产生胰岛素抵抗的主要脏器，本实验采用的HepG2细胞为人肝癌细胞，保留肝的一般生物学特性。利用高于生理浓度的胰岛素诱导HepG2細胞，部分模拟了胰岛素抵抗的自然发病过程。本实验结果也证明了，应用10-6mol/L的胰岛素诱导培养，可使HepG2细胞外的葡萄糖消耗降低、剩余葡萄糖增多，即发生胰岛素抵抗。

本实验在成功建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型基础上进行，通过测定胰岛素抵抗细胞的IGF2BP2基因相对表达量来判定胰岛素抵抗程度与IGF2BP2基因表达程度的相关性。从实验结果来看，可以看出胰岛素抵抗现象最为显著的中浓度组的IGF2BP2基因表达量显著增加，推测两者可能具有相关性。下一步实验，拟研究和IGF2BP2密切相关的分子，探索这一系列分子在胰岛素抵抗发生中所起的作用。

参考文献

[1]张泽生，李雨蒙，张梦娜，等.胰岛素抵抗细胞模型建立及药物评价的研究进展[J].中国食品添加剂，2016，（10）：198-203.

[2]牛洁，刘铜华，杨丽霞.环境因素在2型糖尿病发生中的作用[J].2008，16（4）：440-442.

[3]金水华，吴宁，刘少芳，等.海普诺改善HepG2细胞胰岛素抵抗作用研究[J].海洋科学，2015，35（3）：26-32.