人IL-29定点突变体抗肿瘤细胞增殖活性分析

李利云， 陆 源， 葛春蕾， 彭荣刚，李昕哲，谭 敬， 陈永康，陈 伟*

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122；3.江南大学 无锡医学院，江苏 无锡214122）

人IL-29定点突变体抗肿瘤细胞增殖活性分析

李利云1， 陆 源2， 葛春蕾1， 彭荣刚3，李昕哲3，谭 敬3， 陈永康3，陈 伟*3

（1.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122；3.江南大学 无锡医学院，江苏 无锡214122）

为分析人白细胞介素-29（hIL-29）变异体抗肿瘤细胞增殖活性，采用大引物PCR方法对人hIL-29基因第104位碱基进行点突变，使hIL-29肽链第35位Arg定点改造为Lys。得到的hIL-29变异体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达，经纯化获得重组蛋白rhIL-29mut35。SDS-PAGE分析显示rhIL-29mut35的相对分子质量约23×103，Western Blotting鉴定显示其与羊抗人IL-29多克隆抗体发生特异性结合反应。用CCK-8试剂检测rhIL-29mut35对肿瘤细胞增殖的影响，rhIL-29mut35在不同质量浓度时对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8的增殖均有抑制作用，高剂量组（1 000 ng/mL）rhIL-29mut35对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8增值的抑制率分别为（34.20±1.50）%、（27.30±0.31）%、（30.20±0.68）%、（29.13±1.40）%，与阴性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。而且高剂量组的抗增殖效应高于野生型rhIL-29的（P＜0.01），这为进一步研制开发IL-29的抗肿瘤药物奠定基础。

人白细胞介素-29；定点突变；重组蛋白；抗肿瘤活性

Kotenko等[1]和Sheppard等[2]两个研究小组于2003年共同发现Ⅲ型干扰素，它包括3个成员：IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，即IL-29、IL-28A和IL-28B。IL-29通过结合异源二聚体受体复合物IFN-λR1和 IL-10R2激 活 JAK-STAT（Janus kinase-signal transducer of transcription）信号传导途径，从而发挥其生物学活性[1-2]。IL-29与Ⅰ型干扰素具有相似的生物学性质，如抗病毒、抗肿瘤、抗增殖以及免疫调节等效应[3-5]。Miknis等[6]研究发现，IL-29肽链的某些氨基酸的改变可导致其蛋白质结构发生改变，进而影响其与受体结合的亲和力，从而影响其生物学活性。

文中作者根据生物信息学分析的结果[7]，采用大引物PCR方法对人白细胞介素-29（hIL-29）基因的104位碱基进行突变，使hIL-29第35位Arg定点改造为Lys，期望提高其抗肿瘤活性，从而为深入研究探讨IL-29抑制肿瘤细胞增殖的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株、菌株、质粒 人肺腺癌细胞A549由邱丽颖教授（江南大学无锡医学院）惠赠；人胃癌细胞SGC7901、人结肠癌细胞HCT8和人肝癌细胞BEL7402由金坚教授 （江南大学药学院）惠赠；E.coli JM109，毕赤酵母（Pichapastoris）GS115由本实验室保存；克隆质粒pUCm-T，购自生工生物工程（上海）股份有限公司（简称上海生工）；真核表达质粒pPIC9KM，购自Invitrogen公司并经本实验室改造和保存；重组质粒pPIC9KM-hIL-29（整合了hIL-29全长DNA的pPIC9KM质粒）由本研究室构建并保存[8]，用于表达带有天然N端的hIL-29。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶XhoⅠ、NotⅠ和SalⅠ，T4 DNA连接酶及 250 bp DNA Ladder Marker，低相对分子质量蛋白质标准品，均购于大连Takara公司；Taq plus DNA聚合酶、硝酸纤维素膜（NC膜）、HRP标记兔抗羊IgG、EZ-10柱式DNA回收试剂盒，均购自上海生工；普通新生牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；羊抗人IL-29多克隆抗体，购自美国 R&D公司；改良型RPMI-1640培养基，购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；干扰素α2b标准品，购自北京凯因科技股份有限公司；Cell Counting Kit-8试剂和胰酶细胞消化液，购自碧云天生物技术研究所。

1.1.3 引物设计及合成 以hIL-29基因序列为模板，通过Oligo7软件设计扩增编码hIL-29成熟肽cDNA的特异性上游引物（命名为hIL-29-F）、下游引物 （命名为hIL-29-R）及突变引物 （命名为Mutant Primer）。突变引物中第16位碱基设计为T，使该碱基组成的密码子由AGG突变为AAG，该密码子编码的氨基酸则由Arg突变为Lys。引物序列见表1，引物由上海生工合成。

表1 用于大引物PCR的引物序列Table 1 O ligonucleotides used for megaprimer PCR

1.2 方法

1.2.1 rhIL-29mut35基因的克隆与鉴定 利用大引物PCR方法对hIL-29基因进行定点突变。大引物PCR包括两轮PCR扩增，两轮PCR扩增都以pPIC9KM-hIL-29质粒为模板。第一轮PCR扩增以hIL-29-F和Mutant Primer为引物，反应条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸60 s，2个循环；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，28个循环，72℃延伸10 min，10℃保温。PCR产物经1.2 g/dL琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，按DNA回收试剂盒说明书回收目的片段。以第一轮PCR扩增的回收产物和hIL-29-R为引物进行第二轮PCR扩增，反应条件同第一轮PCR扩增。PCR产物经1 g/dL琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，凝胶成像仪拍照并按DNA回收试剂盒说明书回收目的基因片段。

1.2.2 重组真核表达质粒pPIC9KM-rhIL-29mut35的构建 回收的目的基因片段与pUCm-T连接，化学法转化E.coli JM109感受态细胞。转化液涂布于预先涂有IPTG和X-gal的氨苄抗性琼脂平板上，放置1 h后，倒置培养过夜。蓝白斑筛选阳性转化子进行菌液PCR扩增，条带大小正确的菌株送上海生工测序（命名为JM109/pUCm-T-hIL-29mut35）。将测序正确的pUCm-T-rhIL-29mut35及pPIC9KM质粒双酶切然后割胶回收并连接，转化JM109感受态细胞，菌液PCR条带大小正确的菌株送上海生工测序（命名为JM109/pPIC9KM-hIL-29mut35）。

1.2.3 重组质粒pPIC9KM-rhIL-29mut35的表达及鉴定测序正确用碱裂解法抽提重组质粒pPIC9KM-hIL-29mut35并用 SalⅠ线性化， 电转化法转化P.pastoris GS115感受态细胞，转化液涂布于组氨酸缺陷型的MD平板。G418筛选高拷贝重组菌株。经菌液PCR鉴定正确的进行甲醇诱导表达。发酵条件按照参考文献[9]。发酵上清液经SDS-PAGE（12 g/dL分离胶，5 g/dL浓缩胶）鉴定。

1.2.4 重组蛋白 rhIL-29mut35的纯化及活性分析将发酵液离心收集上清液，经过硫酸铵沉淀初步除去色素和部分杂蛋白质。用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（10 mmol/L，pH 6.0）将沉淀复溶，然后经透析除去部分盐离子；最后经SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析进一步纯化重组蛋白。阳离子交换层析具体步骤按参考文献[10]。SDS-PAGE分析各洗脱峰，将含有rhIL-29mut35的洗脱液冷冻干燥。取冻干粉末用PBS（10 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.2）稀释，Western blotting分析鉴定rhIL-29mut35的活性，具体步骤按参考文献[8-9]。

1.2.5 CCK-8法检测rhIL-29mut35抗肿瘤细胞增殖效应 肿瘤细胞SGC7901、BEL7402、A549和HCT8细胞用改良型RPMI1640完全培养基 （含体积分数10%小牛血清，简称1640完全培养基）在37℃、体积分数5%CO2培养箱培养和传代，取对数生长期的肿瘤细胞用体积分数为0.25%的胰蛋白酶消化后，经血球计数板计数，用1640完全培养基调整细胞浓度为1×105个/mL；按每孔100μL接种于96孔细胞培养板，置37℃、体积分数5%CO2的培养箱培养24 h后，观察细胞贴壁情况，确认贴壁且生长良好后吸去上清液；每孔分别加入100μL用1640完全培养基稀释的阳性对照 IFN-α2b、野生型rhIL-29、rhIL-29mut35，每个样品设置50、500 ng/mL和1 000 ng/mL 3个剂量组，每组设5个平行孔；空白（不接种细胞）和阴性对照组（接种细胞）加入等体积的1640完全培养基，置37℃、体积分数5% CO2的培养箱培养 24 h，每孔加入 10μL Cell Counting Kit-8试剂，继续培养30～60 min（不同细胞测板时间不同）后用酶标仪于450 nm波长处测吸光度（OD450），按式（1）计算各组样品对肿瘤细胞的增殖抑制率。

其中，OD450阴性为阴性对照组OD450值；OD450样品为样品组OD450值；OD450空白为空白组OD450值。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0统计软件进行统计分析，用单因素方差分析各组样品对肿瘤细胞的抗增殖作用的差异，检验水准α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 大引物PCR产物分析鉴定

通过大引物PCR，第一轮PCR产物经1.2 g/dL琼脂糖凝胶电泳分析，可见约130 bp的特异性条带，大小与理论值相符（见图1泳道1）；第二轮PCR产物经1 g/dL琼脂糖凝胶电泳分析，在约560 bp可见特异性条带，且与理论值相符（见图1泳道2）。

2.2 重组质粒测序及序列比对结果

阳性转化子JM109/pUCm-T-hIL-29mut35的测序结果显示其大小为546 bp，编码181个氨基酸；将测定的序列与Gene Bank的hIL-29基因序列（登录号：AY336716.1）比对，结果显示重组质粒JM109/ pUCm-T-hIL-29mut35中目的基因第104位碱基G成功突变为A，且其余序列完全一致（见图2）。重组真核表达质粒JM109/pPIC9KM-hIL-29mut35的测序鉴定结果显示，JM109/pPIC9KM-rhIL-29mut35中目的基因与JM109/pUCm-T-rhIL-29mut35中的完全一致。

图1 大引物PCR结果Fig.1 Result ofmegaprimer PCR

2.3 重组质粒pPIC9KM-rh IL-29mut35在P.pastoris GS115中的表达及鉴定

用3’-AOX和5’-AOX通用引物进行酵母菌液PCR扩增，以空酵母GS115的基因组为模板作对照，扩增出约2 200 bp和500 bp的DNA条带；而以 GS115/pPIC9KM-hIL-29mut35重组子为模板，PCR扩增出约2 200 bp和1 000 bp的特异性条带（见图3），表明hIL-29mut35基因已成功整合入宿主基因组中。鉴定正确的重组子按参考文献[8]条件进行发酵，发酵上清液经SDS-PAGE（12 g/dL分离胶，5 g/dL浓缩胶）鉴定。在约23 000处可见目的蛋白质条带，与理论值相符（见图4）。

图2 h IL-29和rh IL-29mut35的序列比对结果Fig.2 Sequence comparison result of h IL-29 and rh IL-29mut35

图3 GS115/pPIC9KM-rh IL-29mut35的菌液PCR鉴定Fig.3 PCR confirmation of GS115/pPIC9KM-rh IL-29mut35

图 4 GS115/pPIC9KM-h IL-29mut35重组子发酵液上清的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed supernatant of recombinant GS115/pPIC9KM-h IL-29mut35

2.4 rh IL-29mut35的纯化及活性分析

发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析后，再经SPSepharose Fast Flow交换层析洗脱收集洗脱液，用SDS-PAGE分析结果显示，rhIL-29mut35主要出现在含0.6mol/LNaCl的液洗脱峰（峰4），其余洗脱峰为杂蛋白质（见图5）。

图5 rh IL-29mut35的SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析Fig.5 SP-Sepharose Fast Flow cation exchange column of rh IL-29mut35

取纯化的 rhIL-29mut35及未纯化发酵液进行SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示，纯化的rhIL-29mut35在SDS-PAGE及Western blotting图谱上均出现单一条带，其相对分子质量大小约23 000（见图6—7），表明纯化的rhIL-29mut35可与羊抗人IL-29抗体发生特异性结合反应，保持了免疫学活性，可用于体外细胞学活性的检测。

图6 rh IL-29mut35的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of rh IL-29mut35

图7 rh IL-29mut35的W estern blotting鉴定Fig.7 Western blot analysis of rh IL-29mut35

2.5 rh IL-29mut35的抗肿瘤细胞增殖活性

按1.2.5方法检测rhIL-29mut35对4种肿瘤细胞的增殖抑制效应显示，不同剂量组的rhIL-29mut35对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8的增殖均表现出抑制作用（见表2）；尤其高剂量组对4株肿瘤细胞的增殖均具有较强的抑制效应，与阴性对照组相比，差异均具有显著的统计学意义 （P＜0.01）。采用SPSS22.0软件进行统计分析，不同质量浓度rhIL-29mut35对肿瘤 细胞 SGC7901、BEL7402、A549和HCT8的抑制率的P值见表3。

表2 rh IL-29mut35对肿瘤细胞SGC7901、BEL7402、A549和HCT8的抑制率Table 2 Inhibition ratios of tumor cells SGC7901，BEL7402，A549 and HCT8 by rh IL-29mut35

表3 rh IL-29mut35对肿瘤细胞SGC7901、BEL7402、A549和HCT8的抑制率的P值Table 3 P values of inhibition ratios of tumor cells SGC7901，BEL7402，A549 and HCT8 by rh IL-29mut35

方差分析结果显示，rhIL-29mut35、IFN-α2b及野生型rhIL-29对肿瘤细胞SGC7901、BEL7402、A549和HCT8增殖的抑制各有差异。对胃癌细胞SGC7901，高剂量组rhIL-29mut35的抑制效应高于IFN-α2b及rhIL-29的（见图8），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图8 rh IL-29mut35对胃癌细胞SGC7901的抗增殖效应Fig.8 Anti-proliferative effect of rh IL-29mut35on the gastric cancer cell SGC7901

对肝癌细胞BEL7402，中剂量组rhIL-29mut35的抑制效应显著高于IFN-α2b及rhIL-29的，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），而3个样品高剂量组对BEL7402细胞的增值抑制效应差异不大，无统计学意义（见图9）。

图9 rh IL-29mut35对肝癌细胞BEL7402的抗增殖效应Fig.9 Anti-proliferative effect of rh IL-29mut35on the liver cancer cell BEL7402

对肺腺癌细胞A549，高、中和低剂量组rhIL-29mut35的抑制效应均大于野生型rhIL-29及 IFN-α2b的，其中高剂量组的效应显著高于IFN-α2b及野生型rhIL-29，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明rhIL-29mut35对A549的增殖抑制效应较强 （见图10）。

图10 rh IL-29mut35对肺腺癌细胞A549的抗增殖效应Fig.10 Anti-proliferative effect of rh IL-29mut35on the lung adenocarcinoma cell A549

对结肠癌细胞HCT8，高、中和低剂量组rhIL-29mut35的抑制效应均大于野生型 rhIL-29及IFN-α2b的，尤其高、中剂量组的效应显著高于野生型rhIL-29及IFN-α2b，差异具有统计学意义 （P＜0.01），表明rhIL-29mut35对HCT8的增殖抑制作用较强（见图11）。

图11 rh IL-29mut35对结肠癌细胞HCT8的抗增殖效应Fig.11 Anti-proliferative effect of rh IL-29mut35on the colon cancer cell HCT8

3 结语

文中作者采用定点突变方法对hIL-29肽链进行分子改造后，得到的变异体rhIL-29mut35蛋白对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8的增殖抑制作用均高于野生型rhIL-29，表明对hIL-29与受体结合的关键位点进行定点改造可望提高其抗增殖作用。rhIL-29mut35对4种肿瘤细胞增殖表现出不同的抑制效应，可能是因不同肿瘤细胞的IL-29受体表达存在差异[11]。Li等[12]研究表明，IL-29可通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞分裂而抑制肿瘤细胞的增殖，但关键位点氨基酸与IL-29抗肿瘤细胞增殖的构效关系及作用机理还需深入研究，从而为研制开发IL-29的抗肿瘤药物奠定免疫药理基础。

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Anti-Tumor Proliferation Activity of h IL-29 Variant

LILiyun1， LU Yuan2， GE Chunlei1， PENG Ronggang3， LIXinzhe3，
TAN Jing3， CHEN Yongkang3， CHENWei*3
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China；3.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

In order to analyze the antineoplastic activity of human interleukin-29（hIL-29）variant，a mutant gene of hIL-29 was amplified bymegaprimer PCR，and the Arg35 of hIL-29 peptide chain wasmutated to Lys35.A recombinantplasmid was constructed and transformed into Pichia pastoris GS115，the recombinantprotein rhIL-29mut35was induced and purified.The purified rhIL-29mut35had a relativemolecularmass of about 23×103on SDS-PAGE profile and showed specific reaction w ithgoat anti-human IL-29 polyclonal antibody in Western blotting.W ith the Cell Counting Kit-8 reagent，the rhIL-29mut35was found to has anti-proliferation effect on tumor cells SGC7901，BEL7402，A549 and HCT8 separately w ith inhibition ratios of（34.20±1.50）%，（27.30±0.31）%，（30.20±0.68）%and （29.13±1.40）% in the high dose group.The anti-proliferation effect of rhIL-29mut35wasstronger than thatofw ild type rhIL-29（P＜0.01），which supported the developmentof antineoplastic drugsof IL-29.

human interleukin-29，site-directedmutation，recombinantprotein，antineoplastic activity

Q 71

A

1673—1689（2017）05—0553—07

2015-05-04

*通信作者：陈 伟（1956—），男，江西宜丰人，医学博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事免疫学和生物制药方面的研究。

E-mail：chenwei@jiangnan.edu.cn

李利云，陆源，葛春蕾，等.人IL-29定点突变体抗肿瘤细胞增殖活性分析[J].食品与生物技术学报，2017，36（05）：553-559.