肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠内质网应激的影响

常晓东，杨有芹，薛痕，甘华

(1.雅安市人民医院肾脏内科，四川 雅安 625000；2.重庆医科大学附属第一医院肾内科，重庆 400016)

肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠内质网应激的影响

常晓东1，杨有芹1，薛痕1，甘华2

(1.雅安市人民医院肾脏内科，四川 雅安 625000；2.重庆医科大学附属第一医院肾内科，重庆 400016)

目的：探讨肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠内质网应激的影响。方法：30只雄性SD大鼠随机分为3组：正常对照组(n=10)；糖尿病肾病组(n=10)；肾炎康复片组(n=10)。16周后检测大鼠24h尿蛋白及血肝肾功水平。光镜观察大鼠肾组织病理改变。免疫组化方法检测大鼠肾脏葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein78，GRP78)、p-JNK的表达。TUNEL检测肾组织凋亡细胞。RT-PCR检测肾组织GRP78mRNA、CHOPmRNA的表达。结果：18周时，糖尿病肾病组、肾炎康复片组24h尿蛋白水平、血清尿素及肌酐水平均显著高于正常对照组(P<0.05)，血白蛋白水平低于正常对照组。肾炎康复片组血清尿素及肌酐水平较糖尿病肾病组明显降低。糖尿病肾病组、肾炎康复片组GRP78、JNK、生长阻滞和DNA诱导基因153(growtharrestandDNAdamage-induciblegene153，CHOP)表达显著高于正常对照组(P<0.05)，肾炎康复片组较糖尿病肾病组表达明显降低(P<0.05)。结论：内质网应激参与了糖尿病肾病的发生，肾炎康复片可以通过抑制肾脏的内质网应激反应而起肾脏保护作用。

内质网应激；葡萄糖调节蛋白78；生长阻滞和DNA诱导基因153

糖尿病肾病是糖尿病最严重的并发症，也是引起终末期肾病的主要原因之一。糖尿病肾病发病机制目前不清楚。内质网是真核细胞的重要细胞器，其对稳定细胞功能起着重要作用。但各种病理因素会引起细胞内质网的生理功能发生紊乱，称为内质网应激[1]。适度的内质网应激可以促进细胞稳态的恢复，但是持续的内质网应激会引起细胞的凋亡[2]。研究表明：内质网应激参与了糖尿病肾病的发生[3]。肾炎康复片可以延缓糖尿病肾病的发展[4]。但关于肾炎康复片对糖尿病肾病内质网应激的影响，研究的较少。本研究拟观察肾炎康复片对糖尿病肾病大鼠内质网应激的影响，从而探讨肾炎康复片延缓糖尿病肾病发展的机制。

1 材料及方法

1.1 糖尿病肾病大鼠模型的建立

选30只体质量200～220 g的雄性健康SD清洁级大鼠(重庆医科大学实验动物中心提供)，适应性喂养1周后，采用注射链脲菌素(STZ，美国Sigma)方法，将STZ配制成浓度为1%的溶液，按40 mg/kg腹腔内 1 次性注射。STZ腹腔注射两周，尿常规测定出现尿微量蛋白定性阳性。判定为糖尿病肾病形成。选取20只作为实验组。另外选取10只正常对照组。糖尿病肾病大鼠分为糖尿病肾病组(n=10)及肾炎康复片组(n=10)。肾炎康复片组给予肾炎康复片(天津同仁堂药业0.48 g×45片)3次/d，3片/次灌胃。

1.2 标本收集

各组大鼠喂养16周后收集标本。大鼠处死前1 d天收集24 h尿液，作24 h尿蛋白检测。处死大鼠前收集血液标本，标本离心后留取血清-20 ℃冻存备作生化检查。处死大鼠后取出肾脏用生理盐水冲洗，观察肾脏大小、色泽、质地，留取部分肾组织行光镜检查、免疫组化、TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色及RT-PCR。

1.3 血生化及尿蛋白测定

血肝肾功能由全自动生化仪检测。尿蛋白测定采用考马斯亮蓝方法。

1.4 大鼠肾组织病理学检查

肉眼观察肾脏外观情况，4%多聚甲醛固定标本作4 μm石蜡切片，进行HE染色。同时新免疫组化染色并进行免疫组化图像分析。

1.5 TUNEL方法检测肾组织细胞凋亡及结果判断

采用TUNEL方法监测肾组织凋亡细胞情况。

1.6 RT-PCR法测定葡萄糖调节蛋白78、生长阻滞和DNA诱导基因153 mRNA的表达

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)及生长阻滞和DNA诱导基因153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，CHOP)mRNA。其引物如表1。

表1 GRP78、CHOP mRNA引物

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠24 h尿蛋白的变化

与正常对照组相比，糖尿病肾病组大鼠24 h尿蛋白明显增加(P<0.01)，肾炎康复片组大鼠24 h尿蛋白低于糖尿病肾病组(P<0.05)。各组大鼠24 h尿蛋白的变化见表2。

表2 各组大鼠24 h尿蛋白的变化

*P<0.01，#P<0.05，与正常对照组比较；△P<0.05，与糖尿病肾病组比较。

2.2 各组大鼠肝肾功能情况

糖尿病肾病组、肾炎康复片组血清尿素及肌酐水平均显著高于正常对照组(P<0.05)，血白蛋白水平低于正常对照组。肾炎康复片组血清尿毒及肌酐水平较糖尿病肾病组明显降低(P<0.05)，血白蛋白水平较正常对照组升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血肝肾功能水平

*P<0.01，#P<0.05与正常对照组比较；△P<0.05，与糖尿病肾病组比较。

2.3 大鼠肾组织病理学检查

正常对照组肾小球结构清晰，无肾小球硬化，无系膜细胞增生。糖尿病肾病组大鼠肾小球系膜细胞增生明显，有肾小球节段性硬化。而肾炎康复片组肾脏病理改变较高糖尿病肾病组明显减轻。见图1。

2.4 大鼠肾组织免疫组化分析

2.4.1 肾组织GRP78蛋白的表达 糖尿病肾病组大鼠肾组织GRP78蛋白表达叫正常对照组较多。肾炎康复片组大鼠肾组织GRP78蛋白表达较糖尿病肾病组明显降低(P<0.05)，但高于正常对照组(P<0.05)。见图2。

2.4.2 肾组织p-JNK蛋白的表达 糖尿病肾病组大鼠肾组织p-JNK蛋白表达较正常对照组明显较多(P<0.05)。肾炎康复片组大鼠肾组织p-JNK蛋白表达较糖尿病肾病明显降低(P<0.05)，但高于正常对照组(P<0.05)。见图3。

2.5 肾组织凋亡细胞检测

糖尿病肾病大鼠肾组织凋亡细胞较正常对照组明显增多(P<0.01)。肾炎康复片组大鼠肾组织凋亡细胞较糖尿病肾病组明显减少(P<0.05)，但较正常对照组明显增多(P<0.05)。见图4。

2.6 RT-PCR检测大鼠肾组织GRP78、CHOP mRNA的表达

糖尿病肾病组大鼠肾组织GRP78 mRNA表达较正常对照组明显增强。而肾炎康复片组大鼠肾组织GRP78 mRNA的表达较糖尿病肾病组明显减弱，但强于正常对照组。见图5。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病严重的并发症。在我国，糖尿病肾病是引起终末期肾病的第二位原因。据统计,到 2025 年为止,我国糖尿病的人数将达到3.8亿,据估计大约20% 的糖尿病患者会发展成为糖尿病肾病。糖尿病肾病的发病机制十分复杂,其确切的机制尚未完全阐明。糖尿病肾病的主要特点是肾小球过度肥大、系膜增生、基底膜增厚最终引起肾小球硬化,细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下发生的程序性细胞死亡。许多疾病的发生与细胞凋亡有关。研究发现，肾固有细胞的凋亡与肾功能的恶化及肾小球的硬化有关[5]。多种肾脏疾病中均存在着肾固有细胞的凋亡。细胞凋亡也参与了糖尿病肾病的发生[6]。本研究也发现，糖尿病肾病大鼠，肾固有细胞凋亡明显增加。

内质网在蛋白质的合成方面起着重要的作用。但是各种病理因素会引起内质网的生理功能发生紊乱，称为内质网应激。适度的内质网应激对机体起保护作用，可以促进细胞稳态的恢复，但是持续的内质网应激会引起细胞的凋亡。GRP78，在内质网应激中可以帮助蛋白质在内质网的正确折叠，从而维持内质网的稳态。GRP78在内质网应激中表达明显增加。CHOP属促凋亡转录因子，其可以通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2而引起细胞的凋亡。CHOP在生理情况下表达较少，内质网应激时其表达显著增加。通过抑制CHOP的表达，可明显减轻内质网应激引起的细胞凋亡。而促进CHOP的表达，则加重内质网应激引起的细胞凋亡[7]。JNK属于丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)，内质网应激可激活信号调节激酶1 (apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)，进而引起JNK的磷酸化而引起细胞的凋亡[8]。研究发现：内质网应激参与了多种因素引起肾脏损伤。吴小玮等[9]研究发现，慢性肾功能衰竭患者肾组织GRP78表达与24 h尿蛋白成正比。还有研究表明，内质网应激也参与了糖尿病肾病的发生[10]。本研究也发现，糖尿病肾病大鼠内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、JNK表达明显增加。这提示：抑制内质网应激可能延缓糖尿病肾病发展。

肾炎康复片由西洋参、人参、地黄、杜仲(炒)、山药、白花蛇舌草、黑豆、土茯苓、益母草、丹参、泽泻、白茅根、桔梗组成。具有益气养阴，补肾健脾，清解余毒等。许多研究表明肾炎康复片可以延缓糖尿病肾病发展[11]。但其确切机制不明确。本研究发现肾炎康复片可以降低糖尿病大鼠蛋白尿，延缓肾功能恶化。同时发现，肾炎康复片可以减少糖尿病肾病大鼠GRP78、CHOP、JNK表达，同时减少肾固有细胞的凋亡。这提示肾炎康复片可能通过抑制糖尿病肾病大鼠内质网应激引起的肾固有细胞的凋亡而延缓糖尿病肾病大鼠肾功能恶化。

总之，内质网应激参与了糖尿病肾病的发展，而肾炎康复片可以抑制糖尿病肾病大鼠内质网应激，提示肾炎康复片可能通过抑制内质网应激延缓糖尿病肾病发展。

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(学术编辑：谢席胜)

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The effect of Shenyankangfu tablets on endoplasmic reticulum stress in diabetic nephropathy rats

CHANG Xiao-dong1,YANG You-qin1,XUE Hen1,GAN Hua2

(DepartmentofNephrology,1.Ya’anPeople’sHospital,Ya’an625000,Sichuan；2.TheFirstAffliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective：To investigate the effect of Shenyankangfu tablets on endoplasmic reticulum stress in diabetic nephropathy rats.Methods：30 male SD rats were randomly divided into three groups:normal control group (n=10),diabetic nephropathy group (n=10) and Shenyankangfu tablets group (n=10).24 h after 16 weeks,the levels of urine protein and serum hepatic and renal function were detected.The pathological changes of renal tissue in rats were observed with light microscope.The expression of glucose regulated protein 78(GRP78) and p-JNK in rat kidney was detected by immunohistochemistry method.Detection of apoptosis cells in renal tissues with TUNEL.The expression of mRNA GRP78 and mRNA CHOP in renal tissues was detected by RT-PCR.Results:At 18 weeks,diabetic nephropathy group,Shenyankangfu tablets group 24 h urine protein level,serum urea and creatinine levels were significantly higher than the normal control group (P<0.05),serum albumin level was lower than the normal control group.The serum urea and creatinine levels in Shenyankangfu tablets group were significantly decreased than the diabetic nephropathy group.The expression of GRP78,JNK,growth arrest and DNA damage-inducible gene 153(CHOP) in Shenyankangfu tablets group and diabetic nephropathy group was significantly higher than the normal control group (P<0.05),and those in Shenyankangfu tablets group was significanly decreased than the diabetic nephropathy group (P<0.05).Conclusion:The endoplasmic reticulum stress is involved in the occurrence of diabetic nephropathy,Shenyankangfu tablets can play a role in renal protection by inhibition of endoplasmic reticulum stress in the kidney

Endoplasmic reticulum stress;Glucose regulated protein78；Growth arrest and DNA damage-inducible gene 153

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.030

2016-10-26

常晓东(1981-)，男，硕士。E-mail:changxiaodong168@163.com

时间：2017-6-21 18∶10 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1810.060.html

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