响应面法优化热压浸提牛骨蛋白提取工艺

樊晓盼，张伯男，张甜，马俪珍，通信作者

（1. 天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津300384；2. 天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384；3. 山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

响应面法优化热压浸提牛骨蛋白提取工艺

樊晓盼1,2，张伯男1,2，张甜3，马俪珍1,2，通信作者

（1. 天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津300384；2. 天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384；3. 山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801）

以牛骨碎屑为试验对象，通过单因素和响应面优化试验，研究热压浸提条件（料液比、浸提时间和浸提温度）对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响，进而得出利用热压浸提技术提取牛骨蛋白的最佳条件。结果表明：料液比为1:4、浸提时间为4 h、浸提温度为133 ℃时，牛骨碎屑中的蛋白提取率可达到64.73%。

牛骨碎屑；蛋白；响应面法

我国是世界畜产大国，截至2013年，猪牛羊禽肉年产量达到8 373万t，其中畜禽骨占20%～30%[1-4]。畜禽骨中富含蛋白、脂肪以及矿物质等多种人体所需的营养素，且骨蛋白水解物中基本上包括了组成蛋白质分子的所有氨基酸以及部分人体所需的必需氨基酸，且氨基酸构成比例均衡，生物学效价高，属于一种优质蛋白[5-7]。但到目前为止，在人们的日常消费中，仅有排骨能够得到充分利用，而大部分的畜禽骨则因技术水平限制，未能被加工利用或加工成附加值很低的产品，从而造成资源浪费，骨头腐败污染环境[8-11]。

目前，企业生产主要采用热压浸提技术对畜禽骨中的蛋白质进行提取[12-16]。赵永敏等人采用高温高压提取方式对新鲜猪骨、鸡骨和牛骨进行骨素的提取，结果表明，猪骨素的最佳提取工艺为温度135 ℃，时间100 min，料液比1:4，泄压频率 1次/40min[17]；鸡骨素的最佳提取工艺为温度135 ℃，时间60 min，在4 min之内将压力从0.32 MPa泄至0.10 MPa，然后再继续升温，每35 min泄压一次[18]；牛骨素的最佳提取工艺为温度140 ℃，时间140 min，料液比1:4，粒度大小为2 cm[19]。李桂星[20]采用热压抽提法从羊骨中提取骨素，确定羊骨素提取最佳工艺参数为：压力 0.2 MPa，温度132 ℃，料液比1:2.5，时间2 h，破碎度1.5 cm，最终蛋白质提取率为 58.3 %。郇兴建[21]采用高温高压对猪骨营养成分进行提取，结果表明当蒸煮温度为130 ℃、时间3 h、料水比1:1.5时，蛋白质提取率为68.2%，骨油提取率为83.3%。

本研究以牛骨碎屑为主要原料，采用高温高压浸提技术，通过研究料液比、浸提温度和浸提时间对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响，确定热压浸提技术提取牛骨碎屑蛋白的最佳工艺条件，从而为牛骨精深加工利用提供理论及数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：新鲜牛骨。

试剂：浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、溴甲酚绿、甲基红、硼酸、硫酸铜、硫酸钾，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004精密分析天平（上海精科仪器公司）；UDK142凯氏定氮仪（意大利VELP公司）；移液枪（Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

称取100 g牛骨碎屑，在压力为0.2 MPa条件下，分别以料液比（1:1，1:2，1:3，1:4，1:5）、提取时间（0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 h）和提取温度（105、115、125、135 ℃）为影响因素，通过单因素试验研究其对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响。

1.3.2 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，以蛋白提取率为评价指标，利用Design Expert软件设计响应面优化试验，最终确定热压浸提牛骨碎屑蛋白的最优条件。因素水平及编码见表1。

表1 响应面试验因素及水平编码值

1.4 蛋白提取率计算方法

按照 GB 5009.5—2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[22-23]中凯氏定氮法进行测定。

提取液中蛋白质含量占牛骨碎屑蛋白含量的百分比即为蛋白提取率。

式中，m1为浸提物质量；c1为浸提液中蛋白质含量的百分比；m0为原料质量；c0为原料中蛋白质含量的百分比。

1.5 数据处理

用Microsoft Excel 2003计算各个指标的平均值和标准差，Statistix 8.1进行数据分析，显著性差异（P＜0.05）通过 Turkey test程序进行，Sigmaplot 10.0作图。响应面试验采用 Design-Expert 7.0设计并进行结果分析，通过建立回归方程、绘制等高线和三维曲面图，对任意两种因素的交互效应进行分析评价。

2 结果与讨论

2.1 料液比对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响

料液比是指牛骨碎屑与加水量的质量比。由图 1可知，随着加水量的增加，蛋白提取率呈上升趋势，当料液比为1:4时，蛋白提取率达到最高，继续提高水的添加比例，蛋白提取率不会显著增加（P＜0.05），这说明骨头碎屑中的蛋白已经充分溶出，不会再随着加水量的增加而继续被溶出。为了节约资源，降低成本，高压浸提时料液比选择1:4。

图1 料液比对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响

2.2 浸提时间对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响

由图2可知，随着浸提时间的增长，蛋白提取率不断提高。当浸提时间在0.5～3.5 h范围内时，蛋白提取率呈明显上升趋势，浸提时间为3.5 h及以上时则会保持平稳状态。因此浸提时间选择3.5 h。

图2 浸提时间对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响

2.3 浸提温度对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响

由图3可知，浸提温度对牛骨碎屑蛋白的提取率影响较大。浸提温度越高，蛋白提取率显著提高。但考虑企业生产成本和提取效率，选择浸提温度为135 ℃。

图3 浸提温度对牛骨碎屑中蛋白提取率的影响

2.4 响应面试验确定最佳浸提工艺参数

在单因素试验结果的基础上，使用 Design-Expert 7.0软件，依据Box-Behnken 中心组合试验设计原理设计响应面优化分析试验，研究浸提温度（A）、浸提时间（B）和料液比（C）3个因素对牛骨碎屑中蛋白提取率（Y）的影响，响应面试验结果见表2。

表2 响应面中心组合试验设计及结果

对试验结果进行多元回归分析，建立二次回归方程：Y＝63.04＋3.58A＋0.32B－0.24C＋0.97AB＋0.80AC－1.56BC－2.21A2－2.91B2－7.06C2。

对回归模型进行方差分析可知，回归模型P＝0.002 0＜0.01，达极显著，这说明本试验所建立的模型显著回归，所建立的回归方程可以用来明确反映牛骨碎屑中蛋白提取率与其他各因素之间的关系。以蛋白提取率（Y）为响应值的模型中，模型一次项A，二次项B2、C2的P值均小于0.01，差异达到极显著。模型失拟项P＝0.109 3＞0.05，差异不显著，表明该模型与实际试验误差较小，拟合度较高，能够进行模型分析。相关系数R2＝0.973 5，表明采用响应面法设计所建立的回归模型有效，有97.35%的响应值可用来对该模型进行解释，模型适用于热压浸提牛骨碎屑中蛋白试验的理论预测（表3）。

表3 响应面试验回归模型方差分析

2.4.1 响应面分析

图4直观反映了牛骨碎屑蛋白提取率与各个因素之间的相互关系。等高线图的疏密程度用来反映不同因素对蛋白提取率的影响程度，等高线变化越密集，说明该因素对牛骨蛋白提取率影响越大。

图4 任意两因素交互作用对牛骨碎屑中蛋白提取率的响应面图

从图4a可以看出，料液比固定在0水平，浸提温度在125～135 ℃时，牛骨蛋白提取率与浸提时间呈正相关；浸提时间在2.5～4.5 h时，牛骨蛋白提取率与浸提温度也呈正相关。当浸提温度为130 ℃，浸提时间为3.5 h时，蛋白提取率最高。

从图4b可以看出，浸提时间固定在0水平，当温度在125～135 ℃时，牛骨蛋白提取率随着料液比的增加呈先上升后下降的趋势；当料液比在1:1～1:5时，牛骨蛋白提取率随着浸提温度的升高呈缓慢上升而后稳定的趋势。当料液比为1:4，浸提温度129 ℃时，蛋白提取率最高。

从图4c可以看出，浸提温度固定在0水平，浸提时间在2.5～4.5 h时，牛骨蛋白提取率随着料液比的增加呈先上升后下降的趋势。当料液比在1:1～1:5时，牛骨蛋白提取率随着浸提时间的增加呈上升趋势。当料液比为 1:4，浸提时间为 3.5 h时，蛋白提取率最高。

2.4.2 工艺优化与验证试验

分析二次回归方程，可得到牛骨蛋白提取率的最优提取工艺条件为：料液比为1:3.92，浸提时间为3.99 h，浸提温度为132.87 ℃，该条件下蛋白提取率的理论预测值为64.08%。对最佳提取工艺进行验证试验，根据实际生产，将预测条件优化为料液比为1:4，浸提时间为4 h，浸提温度为133 ℃。结果得出在此优化工艺条件下，蛋白提取率为64.73%，与模型理论预测值的吻合度达到99.0%，因此该响应面回归模型具有可行性，具有实际参考价值。

3 结论

本研究以牛骨碎屑为原料，采用热压浸提技术对牛骨碎屑中的蛋白进行提取。根据单因素试验结果选出对蛋白提取率有显著影响的因素（料液比、温度和时间），进行3因素3水平响应面分析试验，最终得到热压浸提牛骨碎屑中蛋白的最佳工艺参数为：料液比为1:4，浸提时间为4 h，浸提温度为133 ℃，在此条件下，蛋白的提取率可达到64.73%。

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责任编辑：张爱婷

Optimization High-temperature and High-pressure Extraction Process of Bovine Bone Protein Using Response Surface Methodology

FAN Xiao-pan1,2, ZHANG Bo-nan1,2, ZHANG Tian3, MA Li-zhen1,2,CorrespondingAuthor
（1. College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300384, China; 3. College of Food Science and Bioengineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi Province, China）

In this study, bone fragments were chosen as raw material. The influence of high-temperature and high-pressure technology on the extraction rate of bovine bone protein were evaluated. Single factors and response surface methodology was used to optimize extraction of bovine protein by using high-temperature and high-pressure technology. The main parameters including the material-fluid ration, extract time and extract temperature, and the extraction rate of protein were the evaluation index. The research results showed that the optimum conditions of extraction are as follows: material-fluid ration is 1:4, extract time is 4 h and extract temperature is 133 . Under the optimal extraction condition, the extraction rate of bovine bone protein ℃was 64.73%.

bone fragments; protein; response surface methodology

TS251.94

：A

2016-06-02

天津市农业科技成果转化与推广项目“可食性牛羊骨素加工关键技术集成及工程化示范”（201604060）

樊晓盼（1993-），女，山西运城人，硕士在读，研究方向：动物源性食品安全与营养学。E-mail：308925471@qq.com。

马俪珍（1963-），女，山西运城人，教授，博士，研究方向：肉品科学与技术。E-mail：malizhen-6329@163.com。

1008-5394（2017）02-0058-05