提高玉米愈伤组织再生率的研究

李海霞，孙金花，邢国珍，王爱武

（河南农业大学，河南郑州450002）

提高玉米愈伤组织再生率的研究

李海霞，孙金花，邢国珍，王爱武

（河南农业大学，河南郑州450002）

为了提高玉米愈伤组织再生率，以1个玉米自交系和3个杂交种的幼胚愈伤组织为试材，接入含有不同浓度2，4-D的分化预处理培养基（N6＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L），2，4-D浓度设0、0.5、1.0和1.5 mg/L计4个处理，培养7 d后转移到分化培养基中进行分化处理，以继代培养7 d的愈伤组织直接转入分化培养基进行植株再生作为对照，研究了不同浓度2，4-D分化预处理对玉米愈伤组织再生率和再生进程的影响。结果表明：愈伤组织在转入分化培养基前进行预处理，可以提高玉米植株再生率。分化预处理培养基以不加2，4-D的效果最好，玉米愈伤组织再生率最高，与对照差异达到了极显著水平，且分化成苗进程加快。不同基因型中，杂交种87-1×郑22的植株再生率最高，与其他2个杂交种差异不显著，但三者的植株再生率均极显著高于自交系87-1。对玉米愈伤组织进行分化前的预处理，可以提高植株再生率，加快再生进程。

玉米；愈伤组织；分化；预处理；再生

生物技术的快速发展为玉米遗传育种提供了新途径，同时也对玉米组织培养体系提出了更高要求。愈伤组织作为基因转化的一种受体，其再生成为转基因技术的关键。自1975年Green等[1]利用玉米幼胚作为外植体诱导出愈伤组织并成功获得再生植株以来，玉米再生体系技术得到了不断完善和发展，已经利用玉米幼穗[2]、芽尖[3]、幼嫩花序[4]、花药[5]、幼苗切段[6]、成熟胚[7]等外植体培养并成功获得了再生植株。研究表明，在培养基中添加一定质量浓度的山梨醇或脱落酸（ABA），可有效提高愈伤组织的植株再生频率[8～10]；对籼稻愈伤组织进行干燥处理后，可使其再生频率极大提高[11]；玉米愈伤组织经过吸湿干燥处理后，可以增加分化前期再生植株的比例[12]。前人对影响愈伤组织再生的生长调节剂研究，主要是在分化培养基中添加不同浓度的KT和6-BA[13～16]。而如何使愈伤组织从脱分化快速进入再分化状态还有待于探讨。利用含有不同浓度2，4-D的培养基对玉米愈伤组织进行分化前的预处理，研究其对玉米愈伤组织再生的影响，旨为提高玉米植株再生率提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料参试玉米愈伤组织为自交系87-1以及杂交种87-1×郑22、郑22×87-1和昌7-2×HⅡA继代培养的胚性愈伤组织。

1.1.2 培养基配方继代培养基：N6＋2，4-D 2.0 mg/L＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L；分化预处理培养基：N6＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖30 g/L＋2，4-D（试验设计的浓度）；分化培养基：N6＋6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋脯氨酸700 mg/L＋水解酪蛋白500 mg/L＋蔗糖20 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织的获取取人工套袋授粉10～14 d的玉米雌幼穗，剥取长1～2 mm的幼胚，在继代培养基上进行愈伤组织诱导和继代培养，继代培养条件为无光照、温度26℃，20 d左右继代1次。

1.2.2 分化诱导预处理挑选生长一致的继代培养的愈伤组织，接入含有不同浓度2，4-D的分化预处理培养基，2，4-D浓度设0.0、0.5、1.0和1.5 mg/L计4个处理，依次记作S0.0、S0.5、S1.0和S1.5；培养7 d后转移到分化培养基中，进行分化处理。以将愈伤组织接入正常继代培养基，7 d后转入分化培养基进行植株再生作为对照（CK）。每处理均接种10个培养皿，愈伤组织接种量10块/皿，统计时去除培养过程中污染的处理。每周统计愈伤组织再生苗数、绿色愈伤数、生根数，以及5周的总出苗数（以苗高1.5 cm以上为出苗标准），计算愈伤组织再生率（%，出苗的愈伤组织块数/诱导再生愈伤组织块数×100）。并肉眼观察不同处理的愈伤组织再生进程。

1.3 数据处理

利用Excel软件对试验数据进行比较、方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度2，4-D分化预处理对玉米愈伤组织再生率的影响

将玉米愈伤组织接入含有不同浓度2，4-D的分化预处理培养基，培养7 d后结果（表1）显示，除了个别预处理外，大部分基因型愈伤组织经过预处理的再生率与CK相比有不同程度的提高，其中，S0.0处理87-1、87-1×郑22、郑22×87-1和昌7-2×HⅡA的再生率分别为13.33%、40.00%、31.33%和27.78%，均明显＞其CK。相同浓度的2，4-D处理下，杂交种87-1×郑22、郑22×87-1和昌7-2×HⅡA的再生率均＞自交系87-1。

表1 不同浓度2，4-D分化预处理对玉米愈伤组织再生率的影响Table 1 Effect differenciation pretreatment w ith different 2，4-D concentration on callus regeneration rate of maize

对分化过程中不同基因型和不同浓度2，4-D分化预处理的愈伤组织再生差异进行方差分析，结果（表2）显示，玉米基因型和2，4-D浓度均对愈伤组织再生有显著影响，其中，基因型的影响极为显著。进一步对不同基因型之间的再生差异进行显著性比较后发现，杂交种87-1×郑22、郑22×87-1、昌7-2×HiⅡA的出苗率差异不显著，但均与自交系87-1差异达到了极显著水平（表3）；对不同浓度2，4-D处理之间的再生差异进行显著性比较后发现，4个分化预处理之间差异均不显著，但是，S0.0处理与CK差异达到了极显著水平，而其他3个处理与CK差异均不显著（表4）。

表2 不同基因型和2，4-D浓度对玉米愈伤组织再生差异的方差分析Table 2 ANOVA analysis of regeneration on genotype w ith different 2，4-D concentration treatment

表3 不同基因型的玉米愈伤组织再生率差异显著性比较Table 3 Difference com parison of regeneration rate w ith difference genotypes

表4 不同浓度2，4-D处理的玉米愈伤组织再生率差异显著性比较Table 4 Difference comparison of regeneration rate with 2，4-D concentration treatment

2.2 不同浓度2，4-D分化预处理对玉米愈伤组织再生进程的影响

不同浓度的2，4-D分化预处理，对玉米愈伤组织再生进程的影响明显不同（表5）。分化第1周，仅S0.0处理下杂交种87-1×郑22和郑22×87-1有苗长出，再生率分别为2.86%和8.89%；而CK无再生苗。分化第2周，S0.0处理的杂交种87-1×郑22和郑22× 87-1的出苗数继续增多，出苗率分别达到了15.71%和14.44%；昌7-2×HiⅡA也开始有苗分化，出苗率为1.11%。分化第3周，CK中仅昌7-2×HiⅡA有1株苗分化，而其他基因型仍没有出苗；自交系87-1 S0.0处理开始有苗分化，分化率为6.67%，而其CK直到第5周才开始有苗分化，分化率为4.00%。表明分化预处理可以加快玉米植株的再生进程，且使绿色愈伤组织和生根数增多。该结果与实际观察结果（图1）一致。

3 结论与讨论

植物生长调节剂对植物组织培养中愈伤组织诱导与分化过程具有重要作用，同种植物生长调节剂的不同浓度、不同植物生长调节剂的相互作用对愈伤组织的诱导与分化产生重要影响。2，4-D能启动脱分化，诱导外植体产生愈伤组织，在继代过程中，2，4-D具有防止愈伤组织褐化的作用[18]。2，4-D是诱导愈伤组织必不可少的因素，其浓度至关重要[19]。各类植物激素的生理作用具有相对的专一性，诱导脱分化与分化的过程需要不同植物激素的调控。2，4-D是诱导体细胞发生的重要物质，主要促进细胞生长。在附加2，4-D的N6或MS培养基上诱导产生大量愈伤组织，但当其转入含有KT和6-BA的培养基后，体细胞生长发育，分化形成再生植株。早在20世纪60年代国外学者就建立了胡萝卜体细胞胚发生体系，胡萝卜在含有2，4-D的MS培养基中可诱导愈伤组织和胚性愈伤组织的形成，当转移至无2，4-D的MS培养基中可诱导体细胞胚的形成与发育[20]。

表5 S0.0处理对玉米愈伤组织再生进程的影响Table 5 Effect of S0.0treatment on callus regeneration proceeding of maize

图1 S0.0处理第1周时的玉米愈伤组织分化状态Fig.1 Comparison the regeneration between CK and S0.0treatment after 1 week

在组织培养中愈伤组织的继代和分化需要不同的植物调节剂，如何缩短2种控制不同培养状态的植物生长调节剂的交互作用时间，使组织细胞尽快以旺盛的生命力从继代培养进入到分化状态，生成再生植株至关重要。本研究采用不同浓度的2，4-D进行分化前预处理，对玉米愈伤组织再生率及再生进程进行研究，结果表明，在培养基中不加2，4-D进行分化前预处理，对提高玉米愈伤组织植株再生率效果明显，各基因型反应一致。低浓度的2，4-D对愈伤组织的处理也与CK有明显区别，普遍提高了玉米愈伤组织的植株再生率。原因是2，4-D浓度降低，减弱了体细胞增生的趋势，愈伤组织一旦转入分化培养基，吸收KT和6-BA后，能使这2种物质快速发挥作用，促进其分化出苗。这种处理方法对提高玉米植株再生率，尤其是某些再生植株困难的基因型有一定的实用价值，并对玉米转基因技术研究具有特别意义。

再生苗的健壮程度是影响组培苗移栽成活率的一个重要因素。实践证明，分化速度快、茎秆粗壮、叶片较宽的再生苗，移栽后缓苗期短，移栽成活率高。在愈伤组织分化过程中，加快愈伤组织植株再生，缩短分化出苗时间对获取健壮植株至关重要。本研究结果表明，不加2，4-D的分化预处理，愈伤组织变绿速度较不进行分化预处理的对照快，且颜色浓绿，绿色面积更大，愈伤组织的分化进程明显加快。因此，分化前降低继代培养基2，4-D浓度对玉米愈伤组织的分化起着一定的调控作用，有利于体细胞胚的形成，对分化有促进作用。

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Study on Improvement of Callus Regeneration Frequency in M aize

LI Hai-xia，SUN Jin-hua，XING Guo-zhen，WANG Ai-wu
（He’nan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

In order to improve the regeneration rate on maize callus，different 2，4-D concentration including 0，0.5，1.0 and 1.5 mg/L were used to pretreatment callus media of N6+700 mg/L proline+500 mg/L casein hydrolysate+30 g/L sucrose.The regenerate rate of different media after 7 days transformation was compared with CK as directly transformation.The effects of different 2，4-D concentration of differentiation pretreatments on callus regeneration frequency and regeneration process were investigated by using one inbred line and three hybrids immature embryos of maize as experimental materials.The results indicated that there was a significant increase on regeneration frequency with different 2，4-D concentration of pretreatments before transferred to differentiation medium. The pretreatment medium without 2，4-D could significantly improve the maize regeneration seedling frequency and accelerate the plant regeneration process.There was a significant different regeneration frequency with various genotype calluses.With the increase of 2，4-D concentration，the regeneration frequency of the same genotype callus was in a downward tendency in the several experimental genotypes.There was a highest regeneration rate on hybrids 87-1×Zheng 22 and no significant difference with other 2 hybrids.The plant regeneration frequency of three hybrids was generally higher than that of inbred line of 87-1.This demonstrated that the pretreatment with maize callus can increase the plant regeneration frequency and accelerate the regenerate process.

Maize；Callus；Differenctiation；Pretreatment；Regeneration

Q813.1

：A

：1008-1631（2017）02-0057-04

2016-09-07

河南省高等学校重点科研项目（15A180039）；河南农业大学本科教学实验室开放项目（KF1613）

李海霞（1972-），女，河南辉县人，实验师，硕士，主要从事植物生理生化研究。E-mail：527801231@qq.com。