结肠乐灌肠液的质量标准研究

孙旭 吴洋 李兴东 刘云云 马晓昱 姚惠凤 陈瑶

结肠乐灌肠液的质量标准研究

孙旭 吴洋 李兴东 刘云云 马晓昱 姚惠凤 陈瑶

目的 建立结肠乐灌肠液的质量标准。方法 采用TLC法对结肠乐灌肠液处方中的药材成分黄芩、黄连进行定性鉴别，并用高效液相色谱法(HPLC)对结肠乐灌肠液中的有效成分盐酸小檗碱的含量进行测定。结果 结肠乐灌肠液中黄芩、黄连的供试品薄层色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；盐酸小檗碱含量在10.84～173.40 μg/mL，范围内线性关系良好(r＝0.999 8)，平均回收率97.71%(n＝6，RSD＝0.55%)。结论 该方法简便快捷，结果准确，可作为该制剂的质量控制方法。

结肠乐灌肠液；质量标准；TLC；高效液相色谱法；盐酸小檗碱

结肠乐灌肠液是解放军第150医院根据多年临床应用研制的纯中药制剂，具有清热燥湿，泻火解毒，收敛止血，止痛，涤荡滞热，抗炎的功效。用于治疗溃疡性结肠炎、慢性结肠炎，特别对远端性结肠炎效果最佳。原有的质量标准中仅有TLC鉴别。为更好的控制结肠乐灌肠液的质量，确保药品安全有效可控，建立了结肠乐灌肠液的定性定量方法。我们采用TLC法对处方中黄芩、黄连等进行了定性鉴别，采用HPLC法建立了主要指标成分盐酸小檗碱的含量测定方法，可为该制剂的质量标准评价提供较为充分的科研依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 薄层层析硅胶G254(青岛海洋化工集团)；ZF-6型三用紫外分析仪；METTLER AE240电子天平；Agilent 1100高效液相色谱仪；AS-B超声波清洗仪；HG-B电热恒温干燥箱。

1.2 试药 乙腈为色谱纯；对照品盐酸小檗碱(批号110713-201212，中国食品药品检定所，纯度：86.7%)，对照药材黄芩(批号120955-201309，中国食品药品鉴定所)、黄连(批号120913-201310，中国食品药品鉴定所)；结肠乐灌肠液(批号140225，140508，140731)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩的TLC鉴别[1-3]取本品30 mL，蒸干，残渣加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液30 mL，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL，超声处理30min使溶解，取上清液作为供试品溶液。另取黄芩对照药材0.5 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液30 mL，同法处理，残渣加甲醇3 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)，精密吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一高效硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)为展开剂，预饱和30min，展开、取出、晾干，置紫外灯(254 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑 点(图1)。

2.2 黄连的TLC鉴别[1-4]取本品10 mL，蒸干，残渣加甲醇10 mL，超声处理30min，过滤，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.5 g，加甲醇10 mL，同法处理作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)试验，精密取上述溶液各5～10 μL，分别点于同一高效硅胶GF254薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-水(6∶3∶1.5∶1.5∶0.3)为展开剂 (同时在展开箱中放入一小烧杯与展开剂等体积的浓氨试液饱和15min)，展开，取出，晾干，置紫外灯(254 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点(图2)。

2.3 盐酸小檗碱的含量测定

2.3.1 色谱条件及系统适用性试验[2]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸溶液(45∶55)(每100 mL溶液加十二烷基磺酸钠0.1 g)为流动相；柱温30℃，检测波长265 nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于2 000。分别吸取对照品溶液，供试品溶液和阴性对照溶液，照色谱条件进样分析，记录色谱峰。结果显示在盐酸小檗碱对照品同一保留时间位置上，供试品溶液出现明显的色谱峰，而阴性对照溶液无感染。HPLC色谱图(图1～2)。

图1 黄芩的TLC图谱

图2 黄连的TLC图谱

2.3.2 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含盐酸小檗碱1.084 mg(对照品储备液)，精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取结肠乐灌肠液10 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇(1∶100)混合溶液20 mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，蒸干，残渣用甲醇溶解，并转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，滤过，即得。

2.3.4 阴性对照溶液的制备 取缺制黄连、黄柏的样品，按“2.3.3”项下方法制备成阴性对照品溶液(图3)。

图3 结肠乐灌肠液的HPLC图谱

2.3.5 线性关系 精密量取盐酸小檗碱对照品贮备液1 mL，2 mL，4 mL，8 mL，16 mL，分别置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即为不同浓度的对照溶液。含盐酸小檗碱分别为10.84、21.68、43.35、86.70、173.40 μg/mL，按2.3.1项下色谱条件分析，以浓度(μg/mL)为横坐标峰面积值为纵坐标，进行线性回归，得盐酸小檗碱的回归方程，Y＝99.02X＋68.70，R2＝0.999 8。在10.84～173.40 μg/mL的范围内线性关系良好。

2.3.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按2.3.1项下条件连续进样6次进行测定，记录盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.26%，表明仪器具有良好的精密度。

2.3.7 重现性试验 取同一批号的结肠乐灌肠液(批号140225)6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行分析。结果盐酸小檗碱的平均含量为0.214 mg/mL，RSD(n＝6)为0.62%，表明方法重复性良好。

2.3.8 稳定性试验 取结肠乐灌肠液(批号140225)，按“2.3.3”项下方法配制供试品溶液，分别于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h进样，按上述色谱条件分别测定，以峰面积计算，结果盐酸小檗碱的RSD为0.59%，表明供试品溶液在12 h内具有良好的稳定性。

2.3.9 加样回收率试验(表1) 取已知含量的结肠乐灌肠液样品(批号140225)6份，加入盐酸小檗碱对照品贮备液2 mL，按“2.3.3”项下制备供试品溶液，依上述色谱条件进样分析，计算回收率。

2.3.10 样品测定 取结肠乐灌肠液样品3批(批号140225，140508，140731)，按“2.3.3”方法制备供试品溶液，按上述色谱条件对盐酸小檗碱的含量进行测定，结果3批样品中盐酸小檗碱的含量分别为0.214 mg/mL，0.162 mg/mL，和0.168 mg/mL。

表1 加样回收率试验测定结果

3 讨论

3.1 TLC鉴别 通过实验，制定了黄芩和黄连的TLC鉴别方法，该方法特征斑点明显色谱分离清晰，可作为结肠乐灌肠液中黄芩和黄连的专属性鉴别。

3.2 波长及流动相的选择 本制剂以黄连为君药，黄柏为臣药，而盐酸小檗碱为黄连和黄柏所共有的主要指标成分，因此将盐酸小檗碱的含量作为该制剂质量控制的指标。取供试品溶液，以水为空白对照，于200～400 nm波长范围内进行扫描，盐酸小檗碱的在波长为230 nm，265 nm，340～350 nm处均有较强吸收峰，文献报道其检测波长有采用265 nm，亦有277 nm，345 nm和350 nm[5-10]，其目的都是减小杂质峰的干扰，增加检测的准确性。本文测定中采用265 nm杂质干扰小，故检测波长确定为265 nm。对多种流动相进行了考察，根据样品的分离度、保留时间等因素，确定了最佳流动相为乙腈－0.1%磷酸溶液(45∶55)(每100 mL溶液加十二烷基磺酸钠0.1 g)。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典2015年版(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015：301，304-305.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典2015年版(四部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015：57-61．

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Objective To establish the quality standards for Jiechangle Enema.Methods TLC was adopted for qualitative identification of Scutellaria baicalensis and Coptis chinensis in the prescription of Jiechangle Enema，and high performance liquid chromatography(HPLC)was adopted to measure the content of Berberine hydrochloride，which was the effective constituent of Jiechangle Enema.Results The lamina chromatogram of test samples of Scutellaria baicalensis and Coptis chinensis in Jiechangle Enema showed spots with the same color as those corresponding spots in the control chromatogram；the content of Berberine hydrochloride was 10.84 ～173.40 μg/mL，with good range linear relation(r＝0.999 8).The average recovery rate of Berberine hydrochloride was 97.71%(n＝6，RSD＝0.55%).Conclusion The established method is simple and convenient with accurate results，which can be used effectively for the quality control of this preparation.

Jiechangle Enema；Quality standard；TLC；High performance liquid chromatography(HPLC)；Berberine hydrochloride

2016-10-09)

军队医疗机构制剂标准提高科研专项课题(14ZJZ01-1)

1005-619X(2017)04-0351-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.04.006

250022 济南军区联勤部药品仪器检验所(孙旭，吴洋，李兴东，刘云云，马晓昱，陈瑶)；471000 解放军第150医院(姚惠凤)

陈瑶