子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌组织cyclin D1的表达特征及与HPV16 E7的相关性

刘晓辉

子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌组织cyclin D1的表达特征及与HPV16 E7的相关性

刘晓辉

目的 探讨细胞周期蛋白 D1(cyclin D1)在子宫颈上皮内瘤变(CIN)及鳞状细胞癌中的表达及其与人乳头状瘤病毒(HPV)16 E7的关系。方法 选择2013-09—2015-09内蒙古自治区赤峰学院医学院附属医院经病理确诊为子宫颈上皮内瘤和宫颈鳞癌的患者以及同期宫颈正常上皮人群作为研究对象，取其子宫颈组织制成石蜡标本。其中子宫颈上皮内瘤81例，宫颈鳞癌40例，宫颈正常上皮50例。采用即时荧光定量PCR、免疫组织化学法检测cyclin D1在三组细胞组织中的基因以及蛋白的表达情况；采用逆转录PCR、W estern blot、免疫组织化学法检测cyclin D1在不同E7表达状态的的三组细胞中的表达情况。结果 正常宫颈组织组cyclin D1表达均为阳性，CIN组和鳞状细胞组只有少数表达为阳性，显著少于正常宫颈组织组，且随着宫颈上皮内瘤变等级的升高cyclin D1表达量逐渐降低；E7基因在正常宫颈组织中不表达或微表达，在CIN组以及鳞状细胞癌组表达更高，以上差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论 子宫颈癌的发生受多重因素影响，HPV感染是该症发生的主要因素。随着宫颈上皮内瘤变等级的升高cyclin D1表达量逐渐降低，且E7基因的高度表达是导致cyclin D1低表达的主要原因。

宫颈上皮内瘤变；宫颈鳞癌；cyclin D1；HPV16 E7

宫颈鳞癌是临床上常见的妇科恶性肿瘤，有研究表明该病的发生与发展与人乳头状瘤病毒(HPV)16，尤其是其E7基因密切相关[1]。细胞周期蛋白D1(cyclin D1)是正常子宫颈上皮细胞一种较为重要的周期蛋白，它与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白共同精密调控细胞增殖[2]。研究表明，cyclin D1参与细胞周期G1/S期的转换，其超常的表达可加速细胞的增殖，与多种癌症的发生和发展有关[3-4]。为了探究cyclin D1在子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌中的表达及其与HPV16 E7的关系，我院特做了一次研究，现将结果报告如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选择2013-09—2015-09我院经病理确诊为子宫颈上皮内瘤和宫颈鳞癌的患者以及同期宫颈正常上皮人群作为研究对象，取其子宫颈组织制成石蜡标本。其中子宫颈上皮内瘤患者81例，其中Ⅰ级34例、Ⅱ级33例、Ⅲ级14例；宫颈鳞癌患者40例，宫颈正常上皮50例。本次研究已获得医院伦理委员会的审核批准。

1.2 研究方法 细胞以及试剂准备：宫颈鳞状癌细胞Hcc94和SiHa细胞、核酸提取试剂盒、HiFi-MMLV Two Step RT-PCR试剂盒。细胞培养：先设计靶向HPV16 E7基因启动子区的siRNA序列，构建质粒转染SiHa细胞，从这批细胞中筛选出稳定沉默E7基因的细胞株，命名为A细胞株。用10%的胎牛血清以及浓度为1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基来培养SiHa细胞和A细胞株，用10%的胎牛血清以及浓度为1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1 640培养基来培养Hcc94细胞，细胞培养均在37℃、5%的CO2条件下培养，利用EDTA胰消化酶实现细胞传代，进行长期细胞实验。

1.3 观察指标 ①观察比较cyclin D1在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织以及鳞状细胞癌组织中的表达情况。②比较不同级别的宫颈上皮内瘤变组织cyclin D1的表达情况。③比较E7基因在Hcc94和SiHa细胞中的表达情况。

1.4 统计学方法 通过SPSS 19.0统计软件分析，定量资料以(±s)表示，组间比较采用t检验，定性资料的组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cyclin D1在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织以及鳞状细胞癌组织中的表达情况对比 正常宫颈组织组cyclin D1表达均为阳性，CIN组和鳞状细胞组只有少数表达为阳性，显著少于正常宫颈组织组，差异具有统计学意义(P＜0.05，表1)。

表1 cyclin D1在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织以及鳞状细胞癌组织中的表达情况对比[n(%)]

2.2 不同级别的宫颈上皮内瘤变组织cyclin D1的表达情况对比 随着宫颈上皮内瘤变等级的升高cyclin D1表达量逐渐降低(表2)。

表2 不同级别的宫颈上皮内瘤变组织cyclin D1的表达情况对比[n(%)]

2.3 E7基因在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织以及鳞状细胞癌组织中的表达情况对比 E7基因在正常宫颈组织中不表达或微表达，在CIN组以及鳞状细胞癌组表达更高，差异具有统计学意义(P＜0.05，表3)。

表3 E7基因在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织以及鳞状细胞癌组织中的表达情况对比[n(%)]

3 讨论

cyclin D1是人体内重要的细胞周期蛋白，与CDK4结合并激活其激酶活性，诱导细胞从G1期进入S期，从而促进细胞增殖。正常情况下，当细胞进入S期后cyclin D1基因则会迅速分解，细胞得以正常增殖[5]。因其他不良因素导致的cyclin D1过量表达则可能导致细胞的大量增殖，导致癌变，与主张cyclin D1与癌症形成与发展密切相关的言论不谋而合。有研究表明，cyclin D1在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织以及鳞状细胞癌组织内的表达正逐渐升高[6]。

在此次研究中，我们发现正常宫颈组织组cyclin D1表达均为阳性，CIN组和鳞状细胞组只有少数表达为阳性，显著少于正常宫颈组织组，且随着宫颈上皮内瘤变等级的升高cyclin D1表达量逐渐降低。此外，E7基因在正常宫颈组织中不表达或微表达，在CIN组以及鳞状细胞癌组表达更高，提示E7基因的高度表达是导致cyclin D1低表达的主要原因[7-8]。这是因为E7基因编码的E7蛋白可以直接与pRb结合，使其高磷酸化，活化核转录因子E2F，诱导细胞进入S期，从而避开了cuclin D1与CDK共同作用下的正常细胞增殖，使得细胞增殖异常[9-11]。因此宫颈癌细胞中尤其是级别较高的细胞中E7基因呈高表达，相应的cycvlin D1则呈低表达。

综上所述，子宫颈癌的发生受多重因素影响，HPV感染是该症发生的主要因素。随着宫颈上皮内瘤变等级的升高cyclin D1表达量逐渐降低，且E7基因的高度表达是导致cyclin D1低表达的主要原因。

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Objective To explore the expression features of cyclin D1 in cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and squamous cell carcinoma and its correlation w ith HPV16 E7.Methods Sufferers diagnosed w ith cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and squamous cell carcinoma and people with normal cervical epithelium at Chifeng College Medical School Affiliated Hospital of the Nei mongol Autonomous Region from September 2013 to September 2015 were taken as the study objects，whose cervical tissues were made into paraffin-embedded specimens.There were 81 cases w ith cervical intraepithelial neoplasia，40 cases w ith cervical squamous carcinoma，and 50 cases w ith normal cervical epithelium.Real time fluorescence quantitative PCR and immunohistochem ical method were adopted to detect the expression of cyclin D1 in genes and albumen of the three kinds of cell tissues；Reverse transcription PCR，Western blot，and immunohistochemical method were adopted to detect the expression of cyclin D1 in the three kinds of cell tissues w ith different E7 expression status.Results The expression of cyclin D1 in the normal cervical tissue group was all positive，while only a little of expression in the CIN group and the cervical squamous carcinoma group was positive，which was clearly less than the normal cervical tissue group.With the rising of cervical intraepithelial neoplasias levels，the expression of cyclin D1 gradually lowered.Gene E7 had no or little expression in normal cervical tissues，but quite high in the CIN group and the cervical squamous carcinoma group，w ith differences of statistical significance(P＜0.05).Conclusion The occurrence of cervical cancer has multiple influencing factors，among which HPV infection is the principal factor.W ith the rising of cervical intraepithelial neoplasias levels，the expression of cyclin D1 gradually lowered，and the high expression of gene E7 is a main cause leading to the low expression of cyclin D1.

Cervical intraepithelial neoplasia；Cervical squamous carcinoma；Cyclin D1；HPV16 E7

2016-07-08)

1005-619X(2017)02-0125-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.02.005

024000 内蒙古自治区赤峰学院医学院附属医院病理科