黑灵芝多糖体内抗炎活性及对甘露糖受体表达的影响

张妍淞，李文娟，汤小芳，聂少平，谢明勇*（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

黑灵芝多糖体内抗炎活性及对甘露糖受体表达的影响

张妍淞，李文娟，汤小芳，聂少平，谢明勇*
（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

目的：研究水溶性黑灵芝多糖（a water-soluble polysaccharides from Ganoderma atrum，PSG）-1体内抗炎活性及对甘露糖受体（mannose receptor，MR）表达的影响。方法：腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立小鼠体内炎症模型，随机分为5 组：正常对照组、LPS组、PSG-1（高、中、低剂量，分别为100、50、25 mg/（kg·d））＋LPS组。流式细胞仪检测巨噬细胞中MR表达、吞噬功能及活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析血清中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6的含量。结果：与正常对照组相比，LPS组腹腔巨噬细胞表面MR表达量下降，与LPS组相比，PSG-1＋LPS组腹腔巨噬细胞表面MR表达量极显著增加（P＜0.01）；与正常对照组相比，LPS组腹腔巨噬细胞吞噬能力和ROS生成增加，与LPS组相比，PSG-1＋LPS组腹腔巨噬细胞吞噬功能和ROS生成显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与正常对照组相比，小鼠经LPS处理后，血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平极显著升高（P＜0.01）；与LPS组相比，小鼠灌胃PSG-1后，PSG-1（高剂量）＋LPS组中TNF-α的含量显著降低（P＜0.05），IL-1β和IL-6的分泌水平无显著差异。结论： PSG-1具有抗炎作用，可部分抑制LPS诱导的体内炎症，其机理与PSG-1促进小鼠腹腔巨噬细胞表面MR的表达、抑制巨噬细胞向M1型极化有关。

黑灵芝多糖；脂多糖；巨噬细胞；甘露糖受体；吞噬功能；炎症因子；极化

Key words: Ganoderma atrum polysaccharide; lipopolysaccharide; macrophage; mannose receptor; phagocytosis; cytokine; polarization

黑灵芝为真菌界、担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌，被奉为灵芝中的上等佳品。Chen Yi等[1]首次从黑灵芝子实体中提取一种水溶性多糖并且用凝胶过滤柱对其进行分离，得到的多糖命名为水溶性黑灵芝多糖（a watersoluble polysaccharide from Ganoderma atrum，PSG-1）。李文娟等[2]通过腹腔注射环磷酰胺建立免疫抑制模型，实验证明PSG-1还能够显著提高免疫抑制小鼠的机体免疫力。张莘莘等[3]通过测定腹腔巨噬细胞培养上清中NO、血清中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β的分泌水平，发现PSG能有效地增强小鼠腹腔巨噬细胞的免疫能力，可改善脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对小鼠腹腔巨噬细胞的诱导作用。研究证实，巨噬细胞功能的发挥与其细胞表面受体密切相关，细胞表面受体可应答外源物或微生物病原体，并诱导随后的细胞内信号级联。目前已发现的细胞表面模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）包括Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）[4]、树突状细胞相关C型凝集素（dendritic cell-associated C-type lectin，Dectin）-1[5]、甘露糖受体（mannose receptor，MR）[6]、清道夫受体（scavenger receptor，SR）[7]等。其中，MR可特异性地识别以甘露糖、岩藻糖或N-乙酰葡糖胺为末端的配体并与之结合，在病原体的识别、吞噬与清除[8]等诸多炎症反应过程中都发挥着重要的作用。张汇等[9]对PSG-1进行结构表征，表明该多糖主要由甘露糖、半乳糖与葡萄糖组成。帅小雪等[10]通过体外培养小鼠腹腔巨噬细胞探讨PSG-1对MR的影响，证实MR能介导PSG-1对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节作用。为了更好地探讨PSG-1对巨噬细胞表面模式识别受体MR的影响，本实验在前期研究的基础上，通过一次性大剂量腹腔注射LPS建立小鼠炎症模型，体内研究PSG-1对炎症模型中巨噬细胞MR表达的影响及其抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

实验动物：BALB/c清洁级小鼠（许可证号：SCXK（湘）2011-0003），雄性，6～8 周，体质量（20±2） g 湖南斯莱克公司。本实验中使用的所有动物，遵循美国国立卫生研究院颁布的《实验动物保护与使用准则》。

PSG-1（纯度＞99.8%）由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自制。

LPS、胎牛血清、异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，FITC-dextran）美国Sigma公司；DMEM培养基 美国Thermo公司；2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美国Molecular Probes公司；FITC-大鼠抗小鼠CD206抗体 英国Abacm公司；TNF-α酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

Varioskan Flash多功能酶标仪 美国Thermo公司；3K15-高速冷冻离心机 美国Sigma公司；FACSCaliburTM流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠体内炎症模型的建立

小鼠分笼饲养于空调温室内，温度（22±2）℃，相对湿度50%～60%，自动调控昼夜各12 h，饲料喂养，自由饮水，实验前静养7 d。然后随机分组，每组10 只，分别是正常对照组、LPS（15 mg/（kg•d），以体质量计，下同）组、LPS＋PSG-1低剂量（25 mg/（kg•d））组、LPS＋PSG-1中剂量（50 mg/（kg•d））组、LPS＋PSG-1高剂量（100 mg/（kg•d））组。PSG组的小鼠均通过灌胃方式给予前处理6 d。同时，空白对照组和LPS组的小鼠通过灌胃方式给予相同体积的生理盐水。在处死之前1 h，腹腔注射LPS建立免疫筛选模型。

1.3.2 ELISA法测定血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量

分离血清，按照小鼠ELISA试剂盒的操作说明测定血清细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平。根据标准曲线计算出相应的含量。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬细胞的分离、纯化及培养

末次处理后，小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇中浸泡3～5 min，取出小鼠，至于无菌培养皿中，腹腔注入5 mL预冷的DMEM培养基，用棉球轻揉腹部2～3 min后吸出腹腔液置于离心管中，重复3 次，收集以上培养基，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，收集巨噬细胞，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基重悬巨噬细胞并接种于培养瓶中，置于CO2培养箱（5% CO2、37 ℃）培养24 h后，轻轻吸弃培养液，用DMEM培养基洗去未贴壁细胞，重复洗涤2 次，即得到纯化的腹腔巨噬细胞。

1.3.4 流式细胞仪检测巨噬细胞表面MR的表达

按上述方法制备纯化的腹腔巨噬细胞，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2 次，加100 µL PBS重悬细胞，加入FITC标记的大鼠抗小鼠CD206抗体10 µL，4 ℃避光孵育30 min。孵育结束后，用PBS洗2次，去除游离的抗体，重悬细胞成单个细胞悬液。流式细胞仪检测巨噬细胞表面MR的表达，记录各标本的阳性细胞百分率，阳性细胞百分率反映细胞群体中被FITC标记的MR抗体的阳性细胞数量所占总细胞数的百分比，阳性细胞百分率越大，表明被FITC标记的MR抗体的阳性细胞数量越多。

1.3.5 FITC-dextran测定巨噬细胞吞噬功能

按上述方法制备纯化的腹腔巨噬细胞，1500 r/min离心5 min，弃去上清液，并以PBS洗涤2 次，加100 µL PBS重悬细胞，加入FITC-dextran（1 mg/mL）10 μL，37 ℃继续孵育1 h。用预冷的含2%胎牛血清的PBS终止反应，洗涤细胞2 次，并重悬细胞。流式细胞仪分析细胞对FITC-dextran的吞噬作用。

1.3.6 流式细胞仪检测巨噬细胞ROS生成

按上述方法制备纯化的腹腔巨噬细胞，约2.0×105～5.0×105个，然后用PBS洗2 遍，1 500 r/min离心5 min。以1∶1000的比例用无血清培养基稀释DCFH-DA，每个细胞样品加入500 μL稀释后的DCFH-DA溶液进行重悬细胞，置于37 ℃培养箱内孵育20～30 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，并用PBS洗3 次以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA，立即用流式细胞仪进行检测，测定细胞内DCF的荧光强度，以DCF的荧光强度来反映细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 PSG-1对炎症模型小鼠体质量的影响

本实验通过PSG-1预处理6 d，第7天一次性注射LPS建立体内炎症模型，观察PSG-1对小鼠炎症的影响。在实验进程中的第1～6天，小鼠每天给予PSG-1或生理盐水处理，观察显示小鼠进食、活动、粪便等一般情况正常，毛发光亮。每天称体质量结果如图1所示，小鼠体质量呈逐渐上升趋势，统计学分析结果显示小鼠各组之间体质量无显著性差异。第7天小鼠正常对照组给予等量的生理盐水，其余各组腹腔注射LPS，1 h后给小鼠称质量，并颈椎脱臼处死，取样。处死小鼠前体表观察结果显示，正常对照组中和PSG组中小鼠毛发光亮，LPS组中小鼠均出现不同程度的脱毛状况，并且在解剖小鼠时发现小鼠有腹泻的情况。

图1 PSG-1对炎症模型小鼠体质量的影响Fig. 1 Effect of PSG-1 on body weight of mice

2.2 PSG-1对小鼠腹腔巨噬细胞表面MR表达的影响

使用FITC-大鼠抗小鼠CD206抗体对巨噬细胞表面MR进行标记，流式细胞仪检测阳性细胞率以反映PSG-1对小鼠腹腔巨噬细胞表面MR表达的影响。如图2所示，与正常对照组相比，LPS组的腹腔巨噬细胞表面MR的表达量由17.17%显著减少到12.39%（P＜0.05），而小鼠灌胃PSG-1后，细胞表面MR表达呈剂量依赖性增加，与LPS模型组相比差异极显著（P＜0.01）。表明PSG-1可上调LPS诱导的炎症模型小鼠腹腔巨噬细胞表面MR的表达。

图2 PSG-1对小鼠腹腔巨噬细胞表面MR表达的影响Fig. 2 Effect of PSG-1 on MR expression on the surface of mice peritoneal macrophages

2.3 PSG-1对炎症模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

处于炎症环境中的巨噬细胞可以通过胞吞作用来清除死亡的细胞。巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的一个重要指标。本研究采用流式细胞仪检测PSG-1对炎症模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。如图3所示，与正常对照组相比，小鼠经LPS刺激后腹腔巨噬细胞的吞噬能力显著增加（P＜0.05）；而小鼠灌胃PSG-1后，腹腔巨噬细胞的吞噬功能较LPS组显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。提示PSG-1抑制炎性环境中巨噬细胞的吞噬能力，减少炎症刺激引起的机体损伤，调节机体的免疫力。

图3 PSG-1对炎症模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响Fig. 3 Effect of PSG-1 on the phagocytosis of FITC-dextran by mice peritoneal macrophages

2.4 PSG-1对巨噬细胞ROS生成的影响

图4 PSG-1对巨噬细胞ROS生成的影响Fig. 4 Effect of PSG-1 on ROS generation in mice peritoneal macrophages

研究表明[11-12]，ROS在炎症反应的发生、发展中起重要作用。在炎症反应中，炎症部位活化的炎性细胞发生呼吸爆发，产生O2－·等活性氧自由基。如果这些ROS自由基过度产生就会使组织细胞坏死、溶解、凋亡，导致严重的组织损害，加重炎性反应。因此阻断ROS自由基的合成和释放可起一定的抗炎作用。本研究对炎症小鼠腹腔巨噬细胞的ROS进行了测定，通过检测DCF荧光强度分析细胞中ROS的水平，如图4所示，LPS组的ROS含量为62.62，与正常对照组相比极显著升高（P＜0.01）；与LPS组相比，小鼠灌胃PSG-1后ROS含量均极显著降低（P＜0.01）。表明PSG-1可能抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞ROS的生成。

2.5 PSG-1对炎症模型小鼠血清分泌TNF-α、IL-1β、IL-6的影响

TNF-α是一种重要的炎症因子，研究发现TNF-α直接参与炎症的病理生理过程。TNF-α具有很强的炎症损伤作用，在机体内是最强炎症介质之一[13]，具有对其他参与炎症反应过程中的炎性因子如IL-6和IL-1β等的诱生、协调和调节作用。因此，通过对TNF-α的抑制能够有效抑制炎症的发生和发展[14]。本实验通过ELISA法检测TNF-α的分泌水平，结果显示（表1），与正常对照组相比，LPS组血清中TNF-α含量均极显著增加（P＜0.01）；与LPS组相比，小鼠灌胃PSG-1后，高剂量组TNF-α的含量显著降低（P＜0.05）。IL-6和IL-1β实验结果显示（表1），与正常对照组相比，LPS组血清中IL-1β和IL-6的含量均极显著增加（P＜0.01）；与LPS组相比，小鼠灌胃PSG-1后，IL-1β和IL-6的含量并无显著降低（P＞0.05）。表明PSG-1可部分抑制LPS介导的炎症反应，降低小鼠分泌细胞因子TNF-α的水平，调控小鼠的机体免疫力。

表1 PSG-1对炎症模型小鼠血清分泌TNF-α、IL-1β、IL-6的影响Table 1 Effect of PSG-1 on the secretion of TNF-α, IL-1βand IL-6 in serum of mice

3 讨 论

炎症是机体对于内在和外在刺激的一种防御反应，是一种十分常见而又重要的基本病理学过程，和许多疾病的发生和发展都有直接关联[15]。巨噬细胞作为机体质量要的免疫细胞，具有可塑性和异质性，在炎症反应中发挥重要的调控作用[16]。在体内外不同微环境的影响下，巨噬细胞可分化为不同表型并表现出功能上的差异，这种现象称为巨噬细胞的极化[17]。在不同环境的刺激下，巨噬细胞可极化为M1型和M2型巨噬细胞。在炎症环境中，巨噬细胞主要表现为M1型。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，为免疫细胞的强烈激活物，可介导机体的炎症反应[18-19]。已证实小鼠腹腔巨噬细胞可被LPS诱导生成M1型巨噬细胞[20]，介导急性促炎反应，且表现为分泌大量的促炎细胞因子如IL-12、TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子，促进ROS大量释放，增强巨噬细胞的吞噬功能，调节并促进1型辅助性T淋巴细胞（Th1型）免疫[21-22]。本实验通过小鼠腹腔注射LPS建立小鼠体内炎症模型，结果发现经LPS刺激小鼠腹腔，腹腔巨噬细胞的吞噬能力增强，ROS和细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平升高。实验结果与前人研究[20]一致，LPS刺激小鼠后，小鼠腹腔巨噬细胞呈现M1型。同时，灌胃PSG-1之后，PSG-1可降低小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力、ROS水平和细胞因子TNF-α的分泌，且具有统计学意义。表明PSG可抑制巨噬细胞向M1型极化，具有抗炎作用。

研究发现多糖主要通过与细胞表面PRR的相结合而介导免疫细胞发挥免疫调节作用[23]。MR属于C型凝集素样受体，主要表达在巨噬细胞、树突状细胞和肾间质细胞等多种细胞[24]，可识别以D-甘露糖、L-岩藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等糖残基为末端的糖类物质[6,25]。PSG-1主要是由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成的杂多糖。体外实验发现MR参与了PSG-1对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节作用[10]。林志辉[26]研究证实在LPS诱导的小鼠急性肺损伤的体内炎症模型中，MR的表达水平显著下调。林志辉[26]和Xu Xuanli[27]等研究发现，促进MR的上调可通过NF-κB信号通路抑制LPS介导的巨噬细胞炎症反应。在此基础上，本研究进一步检测了小鼠腹腔巨噬细胞中MR的表达情况。与前人研究结果相似，本实验结果显示小鼠腹腔注射LPS刺激的炎性状态下，巨噬细胞MR的表达下调，但是同时灌胃PSG-1可显著增加MR的表达。

在炎症状态下，MR抑制炎性因子的释放，调控Th1/Th2型细胞因子的极化分布抑制炎症反应。在参与炎症反应的众多因子中，炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6与内毒素休克的发病与致死具有密切关联[28]。本实验通过ELISA法检测TNF-α的分泌水平，结果显示，与正常对照组相比，LPS组血清中TNF-α含量均极显著增加（P＜0.01）；与LPS组相比，小鼠灌胃高剂量PSG-1后，TNF-α的含量显著降低（P＜0.05）。与正常对照组相比，LPS组血清中IL-1β和IL-6的含量均极显著增加（P＜0.01）；而小鼠灌胃PSG-1后IL-1β和IL-6的含量无显著性差异（P＞0.05）。说明经LPS刺激后，促进小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6产生，加重机体的炎症反应；而PSG-1部分抑制了LPS诱导的炎症反应。MR被证实是在M2型巨噬细胞中高表达，促进2型辅助性T淋巴细胞（Th2）免疫[29]，经由信号转导因子及转录活化因子（signal transducer and activators of transcription，STAT）6信号重塑巨噬细胞，促使炎症因子的合成被抑制，在血管生成、抗炎因子分泌等方面起到重要作用[30]。综合本实验结果说明MR参与了PSG-1的抗炎作用，其机理与其抑制巨噬细胞向M1型极化，促进巨噬细胞向M2极化有关。

综上所述，本实验通过腹腔注射LPS建立体内炎症模型，研究PSG体内抗炎活性及对甘露糖受体表达的影响，发现在体内炎症状态下PSG-1抑制MR表达下调，促进MR的进一步表达。PSG-1的抗炎机理与其抑制巨噬细胞向M1型极化，促进巨噬细胞向M2型极化有关。在以后的研究中，可以从巨噬细胞极化出发，进一步探讨PSG对极化相关信号通路的调控及机制研究。

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In Vivo Anti-Inflammatory Activity of a Polysaccharide from Ganoderma atrum and Its Effect on Mannose Receptor Expression

ZHANG Yansong, LI Wenjuan, TANG Xiaofang, NIE Shaoping, XIE Mingyong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To explore the in vivo anti-inflammatory activity of a water-soluble polysaccharide purified from Ganoderma atrum, named PSG-1, and its effect on mannose receptor (MR) expression. Methods: In the present study, lipopolysaccharide (LPS) via intraperitoneal injection was applied to establish a mouse model of inflammation. Mice were randomly divided into five groups: control group, LPS group, high-dose PSG-1 (100 mg/(kg·d)) + LPS group, mediumdose PSG-1 (50 mg/(kg·d)) + LPS group and low-dose PSG-1 (25 mg/(kg·d)) + LPS group. MR expression, phagocytosis and the level of reactive oxygen species (ROS) in macrophages were analyzed by flow cytometry. The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in serum were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: Compared with the control group, MR expression on the macrophage surface was decreased in the LPS group. In contrast, MR expression on the macrophage surface was significantly increased in the PSG-1 + LPS group in comparison with the LPS group (P ＜ 0.01). Macrophage phagocytosis and the level of ROS in the LPS group were higher than in the control group, which were significantly decreased after administration of PSG-1 (P＜0.05, P＜0.01). After mice were administrated with LPS, the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were significantly increased in serum in comparison with the control group (P ＜ 0.01). Compared with the LPS group, the expression level of TNF-α was significantly decreased after administration of high-dose PSG-1 (P ＜ 0.05), but the expression levels of IL-1β and IL-6 did not significantly change. Conclusion: PSG-1 had an anti-inflammatory effect, being able to partly suppress inflammation induced by LPS in vivo, by promoting MR expression on the peritoneal macrophage surface in mice and suppressing macrophage polarization to M1 phenotype.

2016-05-27

国家自然科学基金地区科学基金项目（31560460）；江西省科技厅自然科学基金项目（20151512041185）；食品科学与技术国家重点实验室项目（SKLF-QN-201509）

张妍淞（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：1540136365@qq.com

*通信作者：谢明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向为食品化学、食品营养与安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201713028

TS201.4

A

1002-6630（2017）13-0167-07

张妍淞, 李文娟, 汤小芳, 等. 黑灵芝多糖体内抗炎活性及对甘露糖受体表达的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(13): 167-173. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713028. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yansong, LI Wenjuan, TANG Xiaofang, et al. In vivo anti-inflammatory activity of a polysaccharide from Ganoderma atrum and its effect on mannose receptor expression[J]. Food Science, 2017, 38(13): 167-173. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713028. http://www.spkx.net.cn