3 种植物挥发油抑制食源性细菌生长活性成分及机理

潘旭迟，许剑锋,*，傅昱晟，吕留庄，于晓巍（.上海海洋大学食品学院，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 0306；.上海市第六人民医院东院，上海 0306）

3 种植物挥发油抑制食源性细菌生长活性成分及机理

潘旭迟1，许剑锋1,*，傅昱晟1，吕留庄1，于晓巍2
（1.上海海洋大学食品学院，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；2.上海市第六人民医院东院，上海 201306）

采用无水乙醇浸法提取柠檬花、茶树叶、留兰香叶挥发油，用抑菌圈法及微量肉汤稀释法测定挥发油对大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonellas enteritidis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抑菌效果，并通过气相色谱-质谱联用分析其有效成分，抑菌机理通过实验菌菌液的电导率及扫描电子显微镜验证。结果表明：柠檬油、茶树油中有效抑菌成分分别为柠檬烯、1,8-桉叶素，其含量分别为65.50%、48.67%，留兰香油中有效抑菌成分为柠檬烯与左旋香芹酮，其含量分别为16.33%、35.67%。其中抑菌广谱性及抑菌效果最好的为留兰香油及其有效活性成分左旋香芹酮。实验中的有效活性物质可能是通过改变实验菌细胞膜的通透性，且可使细菌细胞发生皱缩破裂，以此起到抑菌及杀菌的作用。

抑菌；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；沙门氏菌；扫描电子显微镜；气相色谱-质谱

传统中药材具有杀菌、去热、补中益气等功效[1]，在作为药物原料同时，其提取物因独特的药理性质亦被应用于抑菌、防腐、食品[2]等行业领域。与传统化学防腐抑菌剂，如苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类、硝酸盐及亚硝酸盐、对羟基苯甲酸酯类等[3]相比，天然植物，尤其是药食同源植物提取物更加无毒、高效、安全[4]。有研究表明：苯甲酸钠在人体胃肠道的酸性条件下会转换成毒性较强的苯甲酸，可能引起胃肠功能的衰退，增加肝脏的负担[5]。因此在崇尚绿色、安全、天然的今天，人们趋于寻找“天然源防腐剂”以代替人工防腐剂[6]。

以生态保护与中药的可持续发展为理念，倡导绿色安全的食品与生活[7]，目前有较多对天然源植物挥发油的抑菌[8]及抗肿瘤功效[9]的研究。如：孙立春等[10]制备了14 种植物提取物，并对比证明其中五倍子及石榴皮醇提取物的抑菌效果更优于同质量浓度的山梨酸钾；吕爽等[11]对比分析椒样薄荷与苏格兰留兰香精油的抑菌活性，为其多角度开发提供依据；阿不都拉·阿巴斯等[12]对小檗碱色素、酸浆花萼色素、红景天浓缩液和小茴香浓缩液4 种药用植物抑菌效果，并分析得其抑菌成分对高温稳定。本研究在现有研究基础上改进实验方法，采用天然源植物挥发油及其活性成分进行抑食源性致病菌生长效果与机理研究，旨在筛选天然源植物挥发油中具有广谱抑菌性的产品，以此为天然植物原料筛选提供数据和理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬（花）、茶树（叶）、留兰香（叶） 上海同济大药堂；左旋香芹酮标准品（色谱纯≥98%） 上海阿拉丁公司；柠檬烯标准品（色谱纯≥98%）、1,8-桉叶素标准品（色谱纯≥98%） 上海源叶生物科技有限公司。

供试菌包括大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922）、沙门氏菌（Salmonellas enteritidis CMCC50041）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）、李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC19115） 中国科学院微生物研究所。

胰蛋白胨大豆琼脂、胰酪胨大豆肉汤培养基、MH肉汤培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、2.5%戊二醛、无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司；碘硝基四唑紫（iodonitrotrtrazolium chloride，INT） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

MLS-3750全自动高压蒸汽灭菌锅 日本三洋公司；垂直流超净工作台 新加坡ESCO公司；BPH-9082电热恒温培养箱 上海百典公司；SHP-2008恒温培养振荡器 上海世平实验设备有限公司；DHG-9073B5-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗公司；VOYAGER气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪 美国Finnigan公司；DDS-307A型电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 3 种植物挥发油萃取

称取柠檬花、茶树叶、留兰香叶各200 g，粉碎后放入1 000 mL回流瓶，倒入200 mL无水乙醇，电热套加热回流煮沸5 h，倒出提取液后经纱布过滤，减压抽滤后，倒入旋转蒸发瓶，使用旋转蒸发仪进行减压浓缩，将蒸馏出的溶剂再次倒入回流瓶，回流煮沸，重复进行5 次，得到药材乙醇提取物[13-17]，该提取法药材出油率较高。

1.3.2 3 种植物挥发油抑菌圈实验

参考Chan等[18]方法测定抑菌圈直径。将3 种天然植物挥发油利用DMSO助溶，配制成质量浓度为0.5 g/mL的溶液。将活化后的E. coli、S. enteritidis、S. aureus和L. monocytogenes接种量分别调整至106、105、106、104CFU/mL。用移液枪取0.1 mL，均匀涂布在制备好的平板上，置于37 ℃的恒温培养箱中10 min，使表面干燥，用无菌镊子将滤纸片贴在培养基表面，轻压纸片以确保接触良好。吸5 μL 0.5 g/mL的样品滴于滤纸片表面并做好标记。37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，观察抑菌圈大小并利用游标卡尺测定其直径，3 组平行取平均值，相同质量浓度抑菌圈直径越大抑菌效果越好。

1.3.3 3 种植物挥发油MIC和MBC的测定

参考微量肉汤稀释法[19-20]进行最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定。将3 种提取的挥发油样品溶剂溶解在DMSO中，样品质量浓度配制成100 mg/mL，经二倍系列稀释，得到系列质量浓度为：100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg/mL。实验组每孔加入50 μL菌液和50 μL样品，对照组只加50 μL菌液和50 μL DMSO，将96 孔板置于恒温培养箱中37 ℃条件下培养24 h，取出，每孔加入10 μL的INT溶液，染色30 min后观察颜色变化：活细胞经INT染色后为紫色，无活细胞则不变色，颜色没有变化的最小浓度即为MIC；培养48 h后，颜色没有变化的最小浓度即为MBC。

1.3.4 3 种植物挥发油GC-MS分析

3 种植物挥发油GC-MS分析方法参考文献[21-25]。色谱柱：HP-5弹性石英毛细管柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度60 ℃，以2 ℃/min升温至260 ℃；载气（He）流速1.0 mL/min，进样量0.2 µL；分流比20∶1。

质谱条件：电子轰击（electron impact ion source，EI）离子源；电子能量70 eV；离子源温度270 ℃；激活电压1.5 V；质量扫描范围m/z 29～420；扫描间歇1.0 s；倍增器电压280 V。

1.3.5 柠檬烯、1,8-桉叶素和左旋香芹酮标准品抑菌实验

1.3.5.1 标准品抑菌圈实验

参考Chan等[18]方法测定抑菌圈直径。将柠檬烯、1,8-桉叶素、左旋香芹酮标准品配制成0.5 mg/mL的溶液。以0.5 mg/mL的DMSO作阴性对照[26-27]。具体操作同1.3.2节。

1.3.5.2 标准品MIC和MBC的测定

参考微量肉汤稀释法[19-20]，采用柠檬烯、1,8-桉叶素、左旋香芹酮标准品进行MIC及MBC的测定。将标准品质量浓度配制成100 μg/mL，经二倍系列稀释，得到系列质量浓度为：100、50、25、12.5、6.25、3.13 μg/mL。具体操作同1.3.3节。

1.3.6 3 种植物挥发油的抑菌机理研究

1.3.6.1 电导率的测定

电导率的测定参考文献[28]。将经活化后的实验菌菌液接种于新鲜的胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基中，37 ℃、150 r/min摇床振荡培养6 h。加入适量标准品，使培养液中柠檬烯终质量浓度在E. coli中为100 µg/mL（2×MIC）、在S. aureus中为12.5 µg/mL（2×MIC）、在S. enteritidis及L. monocytogenes中为25 µg/mL（2×MIC）；培养液中1,8-桉叶素最终质量浓度在E. coli中为50 µg/mL（2×MIC）、在S. enteritidis中为100 µg/mL（2×MIC）、在S. aureus中为25 µg/mL（2×MIC）、在L. monocytogenes中为12.5 µg/mL（2×MIC）；培养液中左旋香芹酮最终质量浓度在E. coli、S. aureus、L. monocytogenes中为25 µg/mL（2×MIC）、在S. enteritidis中为50 µg/mL（2×MIC）。将混合均匀的菌液在37 ℃、150 r/min条件下摇床振荡培养12 h。分别在0、2、4、6、8 h取培养液2 mL，在5 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，稀释20 倍，测电导率。以不加标准品的菌液离心后所得到的上清液作为对照测其电导率，实验重复3 次，取平均值。绘制电导率时间变化曲线。

1.3.6.2 扫描电子显微镜观察及样品制备

扫描电子显微镜观察及样品制备参考文献[29]。将经活化后的E. coli、S. enteritidis、S. aureus、L. monocytogenes接种于新鲜的TSB培养基中，按1.3.6.1节方法加入柠檬烯、1,8-桉叶素和左旋香芹酮标准品并调整终质量浓度。在37 ℃、150 r/min条件下摇床振荡培养12 h。先后用戊二醛和锇酸固定后，乙醇脱水、烘干备用。样品经离子溅射金后，即可进行扫描电子显微镜观察。

1.4 数据处理

实验数据均为3 次重复实验的平均值，数据用Excel 2010软件进行处理，计算其平均值与标准差。

2 结果与分析

2.1 3 种植物挥发油抑菌圈直径及MIC、MBC

2.1.1 3 种植物挥发油对4 种菌的抑菌圈直径

表1 3 种植物挥发油对4 种菌的抑菌圈直径Table 1 Mean diameter of area of inhibition of foodborne bacteria when exposed to of volatile oils from 3 kinds of plants mm

对表1分析可知，3 种植物挥发油对4 种实验菌的抑菌圈直径皆在10 mm及以上，其中留兰香油对E. coli、S. enteritidis及S. aureus抑菌效果最好，抑菌圈直径均在18 mm及以上。而对L. monocytogenes的抑菌效果柠檬油表现最好。通过对3 种挥发油建立Matlab的TOPSIS评价模型评价抑菌效果[4]，易得3 种挥发油皆具有广谱抑菌性，抑菌普适性最强的为留兰香油。最终抑菌效果评价为：留兰香油＞柠檬油＞茶树油。

2.1.2 3种植物挥发油的MIC与MBC

表2 3 种天然植物挥发油的MIC、MBCTable 2 MIC and MBC of volatile oil from three kinds of plants mg/mL

由表2可得，3 种挥发油对4 种实验菌皆具有较好的抑菌效果，其中留兰香油抑菌效果最好，在6.25 mg/mL时对E. coli、S. aureus、L. monocytogenes皆具有较强抑制生长的效果，且在50 mg/mL对4 种供试菌皆有杀菌效果。而柠檬油对S. aureus、L. monocytogenes的抑菌效果也较明显，MIC为6.25 mg/mL。杀菌效果方面，柠檬油、茶树油分别对E. coli和S. enteritidis效果不明显，只能在一定程度上起到抑制作用。

2.2 GC-MS分析3 种挥发油主要成分

图1 柠檬油总离子流色谱图（a）、柠檬烯质谱图（b）和GC-MS图（c）Fig. 1 Total ion chromatogram of lemon oil (a), mass spectrum of cinene (b) and GC-MS profile of cinene (c)

由图1分析得，柠檬油中主要成分为柠檬烯（C10H16）[30]，相对分子质量为136.23，保留时间为9.08 min，占挥发油含量的65.50%。

图2 茶树油总离子流色谱图（a）、1,8-桉叶素质谱图（b）和GC-MS图（c）Fig. 2 Total ion chromatogram of tea tree oil (a), mass spectrum of 1,8-cineole (b) and GC-MS profile of 1,8-cineole (c)

由图2可得，茶树油中主要成分为1,8-桉叶素（C10H18O），相对分子质量为154.25，保留时间为6.39 min，占挥发油含量的48.67%。

图3 留兰香油总离子流色谱图（a）、左旋香芹酮质谱图（b）和GC-MS图（c）Fig. 3 Total ion chromatogram of spearmint oil (a), mass spectrum of L(-)-carvone (b) and GC-MS profile of L(-)-carvone (c)

由图3分析，留兰香油中主要成分有两种，分别为柠檬烯（C10H16），相对分子质量为136.23、保留时间为9.08 min，占挥发油含量的16.33%；以及左旋香芹酮（C10H14O），相对分子质量为152.22、保留时间为20.49 min，占挥发油含量的35.67%。

根据GC-MS分析，挥发油所呈现的抑菌效果应与其主要活性物质具有相关性，因此对所分析的3 种活性成分进行进一步研究。

2.3 柠檬烯、1,8-桉叶素与左旋香芹酮的抑菌效果

表3 柠檬烯、1,8-桉叶素及左旋香芹酮抑菌圈直径Table 3 Mean diameter of area of inhibition of foodborne bacterial when exposed to cinene, 1,8-cineole and L(-)-carvone mm

由表3可知，与阴性对照DMSO相比，柠檬烯、1,8-桉叶素与左旋香芹酮对供试细菌都具有极显著抑制效果（P＜0.01），且抑菌谱广，抑菌圈直径均在11 mm以上，其中左旋香芹酮对S. enteritidis的抑制效果最好，抑菌圈达到了19.33 mm。柠檬烯、1,8-桉叶素及左旋香芹酮分别为柠檬油、茶树油和留兰香油的主要成分，与表1中数据对比可得：主要活性成分抑制圈直径均高于各对应挥发油，可认为此3 种活性成分皆能在对应的3 种挥发油中起抑菌活性作用。

表4 柠檬烯、1,8-桉叶素及左旋香芹酮的MIC、MBCTable 4 MIC and MBC of cinene, 1,8-cineole and L(-)-carvone μg/mL

表4中3 种实验样品对S. aureus的MIC皆较小，基本分布在6.25～12.5 μg/mL，说明3种活性成分对S. aureus抑制作用强。其中左旋香芹酮对E. coli、S. aureus和L. monocytogenes 3 种供试菌的MIC都为12.5 μg/mL，对S. enteritidis则为25 μg/mL。结果显示，左旋香芹酮的抑菌效果优于1,8-桉叶素和柠檬烯，但后两者的抑菌效果则需根据特定菌种的实际情况才可进行比较。经线性分析，各主要成分对供试细菌的MIC与其对应挥发油的MIC都有较好的关系，其相关系数分别为0.83、0.98、1.00。从MBC结果中可得，1,8-桉叶素和左旋香芹酮可完全抑制和杀死4 种实验细菌；左旋香芹酮在低剂量（12.5 μg/mL）条件下即对E. coli和S. aureus起到杀菌的作用。综合考虑实验样品的物理性质及抑菌效能，左旋香芹酮因具有良好的抑菌效果及对食品风味破坏程度的最小化，可以采用包合技术或助溶方式作为食品添加剂运用到实际应用中，其应用前景较为广阔。

2.4 柠檬烯、1,8-桉叶素与左旋香芹酮对4 种实验菌菌液电导率的影响

图4 柠檬烯对4 种实验菌菌液电导率的影响Fig. 4 Effect of cinene on electric conductivity of bacterial suspensions

图5 1,8-桉叶素对4 种实验菌菌液电导率的影响Fig. 5 Effect of 1,8-cineole on electric conductivity of bacterial suspensions

图6 左旋香芹酮对4 种实验菌菌液电导率的影响Fig. 6 Effect of L(-)-carvone on electric conductivity of bacterial suspensions

菌液电导率变化是细胞膜渗透性变化的间接表现，3 种标准品柠檬烯、1,8-桉叶素和左旋香芹酮对4 种实验菌菌液电导率影响的实验结果分别见图4～6。菌液的电导率随时间的延长而缓慢增大，加入柠檬烯、1,8-桉叶素和左旋香芹酮后的4 种实验细菌菌液电导率随时间的延长迅速增大，6～8 h时才趋于稳定，实验组的电导率相比对照组更大。总体来看当作用6 h时，实验组电导率与对照组电导率差异最大，说明柠檬烯、1,8-桉叶素和左旋香芹酮皆可改变4种实验细菌细胞膜的通透性，起到抑制生长、杀灭的作用。

2.5 扫描电子显微镜分析

图7 柠檬烯处理前后实验菌效果对比图Fig. 7 Scanning electron micrographs of tested bacteria treated with cinene

图8 1,8-桉叶素处理前后实验菌效果对比图Fig. 8 Scanning electron micrographs of tested bacteria treated with 1,8-cineole

图9 左旋香芹酮处理前后实验菌效果对比图Fig. 9 Scanning electron micrographs of tested bacteria treated with L(-)-carvone

图7 ～9依次为柠檬烯、1,8-桉叶素和左旋香芹酮对4 种实验菌作用前后菌体形态对比图。对照组菌体外观饱满，表面光滑、折光性好；实验组添加培养后菌体产生皱缩、干瘪，且菌体表面有明显凹陷。说明柠檬烯、1,8-桉叶素和左旋香芹酮皆可以对4 种实验菌的生长产生抑制效果，通过破坏细菌细胞膜、使细胞通透性增加、核酸泄漏的方式，最终导致细菌细胞的死亡。

3 结 论

本研究以天然源植物挥发油抑菌效果为基础，发现柠檬油、茶树油和留兰香油对4 种实验细菌都具有抑制效果。其中留兰香油对所有实验菌都起到杀菌作用。从综合抑菌效果上看，留兰香油效果最好。进一步利用GC-MS对柠檬油、茶树油及留兰香油进行抑菌活性物质的分析，得到对应含量最高的化合物分为柠檬烯、1,8-桉叶素与左旋香芹酮，含量分别为65.50%、48.67%和35.67%。相同质量浓度下，左旋香芹酮在抑制4 种实验菌的效果上普遍优于柠檬烯和1,8-桉叶素。其中左旋香芹酮对于E. coli、S. aureus、L. monocytogenes 3 种实验菌的MIC均为12.5 μg/mL，而柠檬烯则在50 μg/mL时对于E.coli有抑制效果，1,8-桉叶素在50 μg/mL对S. enteritidis有抑制效果。左旋香芹酮在12.5 μg/mL就对E. coli和S. aureus具有较好杀菌效果，对S. enteritidis的MBC则为50 μg/mL，但柠檬烯对S. enteritidis杀菌效果不明显。通过菌液的电导率验证实验证明3 种化合物皆可改变细菌细胞膜的通透性，起到抑制生长、杀菌的作用。而根据扫描电子显微镜照片细菌细胞形态对比，发现加入活性化合物的细菌发生皱缩、干瘪、且菌体表面有明显的凹陷，同样证明了3 种化合物对于实验菌具有抑制生长繁殖、破坏细胞膜、使细胞膜通透性增加、大分子物质泄漏的作用，最终可以导致细菌细胞死亡，证明了柠檬烯、1,8-桉叶素和左旋香芹酮分别为柠檬油、茶树油和留兰香油的主要抑菌成分。

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Antibacterial Ingredients and Mechanism of Volatile Oils from Three Kinds of Plants against Foodborne Bacteria

PAN Xuchi1, XU Jianfeng1,*, FU Yusheng1, LÜ Liuzhuang1, YU Xiaowei2
(1. National Experimental Teaching Demonstration Center for Food Science and Engineering, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Sixth People’s Hospital East Campus, Shanghai 201306, China)

The antibacterial effects of the volatile oils extracted with absolute ethanol from lemon flowers (Citrus limon), tea tree leaves (Melaleuca alternifolia) and spearmint leaves (Mentha spicata L.) against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonellas enteritidis and Listeria monocytogenes were investigated in this study, and their active ingredients were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Meanwhile, the antibacterial mechanism was evaluated by determining the electric conductivity of bacterial suspensions and observing bacterial cells by scanning electron spectroscopy (SEM). The active ingredients were identified as cinene (65.50%) in lemon oil, 1,8-cineole (48.67%) in tea tree oil, and cinene (16.33%) and L(-)-carvone (35.67%) in spearmint oil. Among these, spearmint oil and its L(-)-carvone had the broadest antibacterial spectrum and strongest antibacterial activity. SEM examination showed that the bacterial cells were crumpled and ruptured after active ingredient treatment, demonstrating these substances could effectively suppress bacterial growth and reproduction by changing cell membrane permeability.

antibacterial effect; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; Salmonellas enteritidis; scanning electron microscope (SEM); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

10.7506/spkx1002-6630-201713024

TS201.3

A

1002-6630（2017）13-0143-07

潘旭迟, 许剑锋, 傅昱晟, 等. 3 种植物挥发油抑制食源性细菌生长活性成分及机理[J]. 食品科学, 2017, 38(13): 143-149. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713024. http://www.spkx.net.cn

PAN Xuchi, XU Jianfeng, FU Yusheng, et al. Antibacterial ingredients and mechanism of volatile oils from three kinds of plants against foodborne bacteria[J]. Food Science, 2017, 38(13): 143-149. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201713024. http://www.spkx.net.cn

2016-05-31

上海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划项目（ZY3-CCCX-3-3044）

潘旭迟（1995—），女，本科生，研究方向为生物技术（海洋生物制药）。E-mail：panxuchi1514@126.com

*通信作者：许剑锋（1968—），男，副教授，博士，研究方向为海洋天然药物。E-mail：jfxu@shou.edu.cn