高压脉冲电场结合糖基化对β-乳球蛋白过敏原性与功能性质的影响

田 明，涂宗财,2,*，王 辉，杨文华，李 雪，宋启东（.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022）

高压脉冲电场结合糖基化对β-乳球蛋白过敏原性与功能性质的影响

田 明1，涂宗财1,2,*，王 辉1，杨文华1，李 雪1，宋启东1
（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022）

采用高压脉冲电场（pulsed electric field，PEF）结合糖基化处理β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg），在β-Lg与半乳糖质量比1∶2、反应温度60 ℃、反应时间3 h、pH 7.4和不同PEF强度反应条件下，研究改性前后β-Lg的过敏原性和功能性质的变化。结果表明，经过PEF结合糖基化处理后，β-Lg自由氨基含量显著降低，β-Lg过敏原性有一定程度下降，15 kV/cm PEF处理90 μs后进行糖基化，过敏原性降低程度最大；在此条件下，β-Lg的溶解性、乳化性、乳化稳定性及抗氧化活性显著提高（P＜0.05）。这为制备低致敏性且功能性质好的β-Lg提供了一种新的方法。

脉冲电场；糖基化；β-乳球蛋白；过敏原性；功能性质

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）是牛乳清蛋白的主要成分，营养丰富、能与脂肪酸和脂溶性维生素结合[1]。尽管如此，由于其高度的致敏性，使得β-Lg在食品工业中的应用受到限制。近年来，国内外对降低β-Lg的过敏原性进行了大量研究[2-4]。其中，利用化学改性如糖基化[5]、磷酸化[6]等较为普遍。如Li Zheng等[7]利用麦芽糖对α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行糖基化修饰，两种蛋白的过敏原性显著降低；Zhong Junzhen等[8]采用低聚果糖与β-Lg结合，β-Lg的过敏原性降低的同时其溶解性、乳化性和乳化稳定性等功能性质都得到改善；Taheri-Kafrani等[9]研究发现糖基化能够降低β-Lg的过敏原性，且反应程度越高对过敏原性影响越大。然而，目前鲜见脉冲电场结合糖基化对β-Lg的过敏原性进行研究。高压脉冲电场（pulsed electric fields，PEF）是一种新型非热食品杀菌技术，与传统的杀菌技术相比，不仅能够杀死致病菌、钝化酶类，还对食品原有的营养、风味、色泽等损害较少。当前，有关PEF对食品蛋白质的研究主要集中在蛋白质的理化性质，而鲜少见关于PEF对蛋白过敏原性的报道。

目前，国内外采用复合改性技术降低蛋白质过敏原性的报道较少。Zhong Junzhen等[10]通过动态高压微射流协同糖基化改性β-Lg，β-Lg的过敏原性得到显著降低；López-Expósito等[11]研究发现超高压结合酶解法改性卵清蛋白，发现卵清蛋白的过敏原性明显降低；Sun Weiwei等[12]利用PEF结合糖基化处理乳清分离蛋白，发现乳清分离蛋白的溶解性和乳化性得到改善，而且高强度的PEF处理能够促进糖基化反应；Guan Yongguang等[13]研究发现PEF处理可以促进牛血清白蛋白-葡聚糖溶液体系的糖基化反应。因此，本实验通过PEF结合糖基化复合改性β-Lg，探究其过敏原性的变化，并且测定改性后蛋白的功能性质是否得到改善，这对PEF加工控制过敏原蛋白致敏性的关键技术研究具有理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-乳球蛋白、半乳糖、鱼皮明胶 美国Sigma公司；患者血清 美国PlasmaLab International公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）等其他所需试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PEF设备由中国农业大学与清华大学自主研发；F-7000荧光光谱仪 日本日立公司；HF2000酶标分析仪北京华安麦科公司；TU-1810紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 PEF处理

用10 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）将β-Lg配制成1 mg/mL的溶液，处理时间为90 μs，电场强度为0、5、15、25、35 kV/cm。电场强度（E）和总处理时间（t）计算见公式（1）、（2）[5]。

式（1）、（2）中：U为实际电压/kV；d为电极板间距/cm，取0.4 cm；n为处理室个数；V为处理腔体积/mL，0.05 mL；f为频率/Hz；W为脉宽/μs；v为流速/（mL/s）。

1.3.2 糖基化处理

参照Zhang Qiuting等[6]的方法稍作修改，向PEF处理后的样品溶液中按糖与蛋白质量比2∶1加入半乳糖，混匀，冻干。将冻干后的粉末置于培养箱中在60 ℃、74%相对湿度（饱和氯化钠溶液）条件下反应3 h，糖基化反应结束后，加入预先冷却的超纯水复溶到质量浓度为2 mg/mL，并置于4 ℃待用。

1.3.3 自由氨基含量的测定

采用邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）法[7]测定自由氨基含量：称200 mg OPA溶于5 mL的甲醇溶液，再分别加入2.5 g十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），4.75 g硼砂及0.5 mL β-巯基乙醇，蒸馏水定容至250 mL。此试剂现配现用，避光保存。取4 mL上述OPA试剂于试管中，加入200 µL样品溶液，空白为200 µL蒸馏水代替样品，混匀后于室温条件下反应2 min，340 nm波长处测吸光度。以不同质量浓度（0.0～0.4 mg/mL）的赖氨酸作标准曲线，根据标准曲线计算样品中自由氨基的含量。

1.3.4 过敏原性的测定

1.3.4.1 过敏患者血清库

本实验所用的血清为4 个已被确诊为牛乳过敏患者的血清。4 个人（P1、P2、 P3、P4）过敏症状如表1所示。

表1 牛乳过敏患者病史Table 1 Clinical history of patients with milk allergy

1.3.4.2 过敏原性的测定

采用间接酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测β-Lg的过敏原性（用IgE结合能力表示），以正常人血清作为阴性对照。酶标板中每孔加入100 μL 10 μg/mL处理后的β-Lg溶液，37 ℃、1 h；每孔加入250 μL 质量分数为1%的鱼皮明胶进行封闭，37 ℃、1 h ；加入100 μL一定稀释比的患者血清，37 ℃、1 h；加抗人IgE酶标二抗，每孔100 μL，37 ℃、1 h，每步操作之后均用PBST溶液洗涤3 次并拍干；加显色液四甲基联苯胺显色，37 ℃避光反应15 min，最后加100 μL 2 mol/L H2SO4溶液终止反应，酶标仪450 nm波长处测吸光度[17]。

1.3.5 溶解性的测定

采用福林-酚法[18]测定可溶性氮的含量，取100 μL 1 mg/mL的样品溶液至10 mL离心管中，加900 μL蒸馏水，加入5 mL试剂A，混匀，于20～25 ℃放置 10 min，再分别加0.5 mL试剂B，立即混匀，在室温反应10 min，然后于500 nm波长处测吸光度。空白以1 mL蒸馏水代替样品作为对照，以不同牛血清蛋白质量浓度（0～250 μg/mL）为横坐标，对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.6 乳化活性及乳化稳定性的测定

取9 mL 1 mg/mL的样品溶液和3 mL大豆油在50 mL的离心管中，混匀，在T18分散机中7 200 r/min分散2 min。随后立即从离心管底部取50 μL乳浊液加入5 mL质量分数为0.1%的SDS溶液中，混匀，500 nm波长处测吸光度（A0）。10 min时再从离心管底部取50 μL乳浊液加到5 mL 0.1% SDS溶液中，500 nm波长处测吸光度（A10）[19]，乳化活性指数 （emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）的计算见公式（3）、（4）。

式中：DF为稀释倍数；ρ为蛋白质质量浓度/（g/mL）；θ为乳状液中油体积分数（0.25）；t为10 min。

1.3.7 DPPH自由基清除率的测定

采用Stanic-Vucinic等[20]的方法加以改动后测定。取1 mL 2 mg/mL样品溶液与4 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L溶于甲醇）混合后，避光反应30 min，517 nm波长处测定其吸光度。对照采用蒸馏水代替样品溶液，DPPH自由基清除率用公式（5）计算。

式中：As为样品的吸光度；Ac为对照品的吸光度。

1.3.8 Trolox当量抗氧化能力的测定

采用2,2’氨基-（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）二铵盐（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）试剂盒检测样品的Trolox当量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）。在酶标板中，每孔加入200 μL ABTS工作液；样品孔内加入10 μL 2 mg/mL的样品溶液；空白对照加入10 μL PBS溶液，标准曲线孔内加入10 μL一定浓度的Trolox标准溶液（0.15～0.90 mmol/L），混匀；室温反应2～6 min后用酶标仪在734 nm波长处测定其吸光度，根据标准曲线算出样品的TEAC。

1.4 数据统计与分析

实验数据采用Origin 8.6软件作图，SPSS 17.0软件进行显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 PEF结合糖基化反应对β-Lg自由氨基含量的影响糖基化反应是单糖、还原糖中的羰基或羰基化合物与蛋白质中的氨基共价结合的化学反应。因此可以通过蛋白质的自由氨基含量来反映糖基化反应程度。从图1可以看出，β-Lg经PEF结合糖基化处理后，自由氨基含量显著降低，说明糖基化后β-Lg与糖分子发生了共价结合，而且随着脉冲场强的增大有下降趋势，可能的原因是经高强度脉冲强度处理，β-Lg的空间结构展开程度更大，β-Lg分子中的氨基暴露在蛋白分子表面，糖基更易与氨基发生共价结合，使得β-Lg的自由氨基含量显著降低[21]。

图1 PEF结合糖基化反应对β-Lg自由氨基含量的影响Fig. 1 Effect of PEF combined with glycation on the free amino group content of β-Lg

2.2 PEF结合糖基化反应对β-Lg过敏原性的影响

图2 PEF结合糖基化反应对β-Lg过敏原性的影响Fig. 2 Effect of PEF combined with glycation on the allergenicity of β-Lg

脉冲电场结合糖基化反应对β-Lg过敏原性（用IgE结合能力表示）的影响如图2所示。当处理时间为90 μs时，随着PEF场强的增加，β-Lg的IgE结合能力呈先降低后升高的趋势。在场强为15 kV/cm时，其IgE结合能力达到最小，随着场强的进一步增大，IgE结合能力增加且此后呈稳定趋势。可能的原因是，在场强小于15 kV/cm时，β-Lg分子发生去折叠，使糖基化位点暴露，导致更多的过敏位点被修饰，因此IgE结合能力随场强的增加而降低，且在15 kV/cm时降低至最小值。然而，随着场强的进一步增加，β-Lg分子发生聚集，使糖基化位点被掩盖，导致过敏位点修饰减少，因此，IgE结合能力逐渐增加且呈稳定趋势。

蛋白的过敏原性与蛋白的空间构象有关。据报道，90%的患者血清的过敏表位为Val41-Trp60、Tyr102-Arg124 和Leu149-Ile162，是β-Lg的主要过敏表位[22]。经过糖基化反应后，过敏表位与糖基发生共价结合，导致IgE结合能力下降[9]。而脉冲电场处理会引起β-Lg的空间结构发生改变，可能破坏或隐藏了过敏表位，从而导致IgE结合能力降低。由图2可知，4 个患者（P1、P2、P3、P4）对β-Lg的IgE结合能力是不同的（而阴性血清IgE结合力低于0.1，未在图中标示），如P2患者血清所得复合改性对β-Lg的IgE结合能力影响的结果不是很明显，显然患者之间存在个体差异。经过复合改性后的β-Lg的IgE结合能力均有不同程度的降低，而且在电场强度15 kV/cm条件下处理的β-Lg的IgE结合能力下降程度最大。

2.3 PEF结合糖基化反应对β-Lg溶解性的影响

图3 PEF结合糖基化反应对β-Lg溶解性的影响Fig. 3 Effect of PEF combined with glycation on the solubility of β-Lg

溶解性是蛋白质主要的功能特性之一，是其他功能特性的基础。从图3可以看出，热处理后的β-Lg溶解性有一定程度降低，可能是由于加热过程导致蛋白发生聚集，因此溶解性降低[10]。此外，经过糖基化处理的样品溶解性明显升高（P＜0.05），且PEF结合糖基化复合改性后的溶解性比单一糖基化处理的样品溶解性要高（P＜0.05）。这是由于糖基化反应，引入了亲水性糖基，使得蛋白质的亲水基团数量增多，溶解性升高[23]。而PEF处理会促进糖基化反应，使得β-Lg与更多的糖基进行结合，溶解性进一步提高[6]。

2.4 PEF结合糖基化反应对β-Lg乳化性能的影响

蛋白质是一种天然的两性物质，具有良好的乳化性能。由图4、5可知，加热后的β-Lg的乳化活性略有降低。原因是加热会诱导蛋白发生聚集，分子柔性降低，乳化活性降低，这与Chevalier等[16]研究结论一致；而经过糖基化反应处理后，乳化活性略有提高，且经过PEF结合糖基化复合改性后样品的乳化活性和乳化稳定性达到最大（P＜0.05）。一方面，因为糖与蛋白发生共价交联，亲水性的糖基增加了复合物的表面活性，从而乳化活性提高；另一方面，PEF处理使蛋白结构展开，分子柔性提高，产生和暴露了更多的疏水性区域，表面疏水性增大，从而乳化活性进一步提高[24]。糖基的引入可增加油/水乳化系统中水相的黏度，同时油/水界面张力也会降低，而且共价结合的糖分子链在吸附膜的周围形成立体网状结构增加膜的厚度和机械强度，从而增加了乳化液的乳化稳定性[25-26]。根据Sun Weiwei等[12]的研究，PEF处理能够促进糖基化反应的进行，而且能够改善蛋白质的乳化活性和乳化稳定性等功能性质。

图4 PEF结合糖基化反应对β-Lg乳化活性的影响Fig. 4 Effect of PEF combined with glycation on the emulsifying activity of β-Lg

图5 PEF结合糖基化反应对β-Lg乳化稳定性的影响Fig. 5 Effect of PEF combined with glycation on the emulsion stability of β-Lg

2.5 PEF结合糖基化反应对β-Lg的DPPH自由基清除能力的影响

图6 PEF结合糖基化反应对β-Lg DPPH自由基清除能力的影响Fig. 6 Effect of PEF combined with glycation on the DPPH scavenging activity of β-Lg

DPPH自由基的清除是糖基化产物提供氢自由基，形成稳定的DPPH-H化合物，其紫色变浅或变黄，形成稳定的反磁化分子。由图6可知，经糖基化反应处理后的DPPH自由基清除能力显著提高（P＜0.05），而且经

PEF结合糖基化复合处理后的样品其DPPH自由基清除能力达到最大（P＜0.05）。原因是糖基化处理后，生成的糖基化产物能够提供氢键，DPPH自由基与氢键结合形成DPPH—H分子，从而DPPH自由基清除能力提高。有研究发现，自由基清除能力与糖基化产物的褐变程度有关，而PEF能够促进糖基化反应，因此PEF结合糖基化后样品的DPPH自由基清除能力进一步提高[7,27]。

2.6 PEF结合糖基化反应对β-Lg TEAC的影响

图7 PEF结合糖基化反应对β-Lg TEAC的影响Fig. 7 Effect of PEF combined with glycation on the Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) of β-Lg

ABTS法广泛应用于评价食品和酚类等物质的抗氧化能力，该方法快速简便。由图7可知，经糖基化处理后的β-Lg的TEAC要高于原蛋白和加热后的蛋白质（P＜0.05），表明糖基化处理可以提高β-Lg的抗氧化能力。原因是ABTS可被氧化生成蓝绿色的ABTS＋·，在有供氢能力的抗氧化剂存在下，ABTS＋·可与之反应，变成无色或浅色的ABTS。糖基化产物可以作为供氢体，从而使得糖基化改性后的β-Lg的自由基清除能力提高[28]。分析DPPH自由基清除能力和TEAC的数据可以看出，β-Lg在两种评价体系中的自由基清除力有所不同，说明同一种物质在不同抗氧化评价体系表现出的自由基清除能力可能不同，这与Maillard等[29]的研究相似。可见，PEF结合糖基化复合改性β-Lg能够改善其抗氧化活性。

3 结 论

综上所述，β-Lg经PEF结合糖基化改性后，过敏表位被修饰和覆盖，从而导致过敏原性降低。用不同电场强度（5～35 kV/cm）PEF结合糖基化处理后，β-Lg过敏原性呈先降低后升高再趋于稳定的趋势，且在15 kV/cm PEF处理后进行糖基化，过敏原性降低程度最大，在此条件下过敏原性降低的同时其溶解性、乳化性、乳化稳定性和抗氧化活性均显著提高。这为制备一种致敏性低且功能性质良好的β-Lg提供了一种新的方法。

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Effect of Glycation Combined with Pulsed Electric Field Pretreatment on Allergenicity and Functional Properties of β-Lactoglobulin

TIAN Ming1, TU Zongcai1,2,*, WANG Hui1, YANG Wenhua1, LI Xue1, SONG Qidong1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

This research aimed to investigate the effect of pulsed electric field (PEF) pretreatment combined with glycation on the allergenicity and functional properties of β-lactoglobulin (β-Lg). After being subjected to PEF treatment at different electric intensities, β-Lg solution was added with galactose at a ratio of 1:2 and then they were allowed to react at pH 7.4 and 60 ℃ for 3 h. The results showed that glycation after PEF pretreatment significantly reduced the free amino group content of β-Lg and decreased the allergenicity. The lowest allergenicity of β-LG was observed by PEF pretreatment at 15 kV/cm for 90 µs, accompanied by a significant improvement in the solubility, emulsifying property, emulsion stability and antioxidant activity (P ＜ 0.05). Therefore, glycation combined with PEF pretreatment will have potential application for producing β-Lg with low allergenicity and favorable functional properties.

pulsed electric field; glycation; β-lactoglobulin; allergenicity; functional properties

10.7506/spkx1002-6630-201713015

TS252.1

A

1002-6630（2017）13-0090-06

田明, 涂宗财, 王辉, 等. 高压脉冲电场结合糖基化对β-乳球蛋白过敏原性与功能性质的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(13): 90-95. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713015. http://www.spkx.net.cn

TIAN Ming, TU Zongcai, WANG Hui, et al. Effect of glycation combined with pulsed electric field pretreatment on allergenicity and functional properties of β-lactoglobulin[J]. Food Science, 2017, 38(13): 90-95. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201713015. http://www.spkx.net.cn

2016-05-11

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102205）

田明（1993—），男，硕士研究生，研究方向为食物资源的开发与高效利用。E-mail：13576935021@163.com

*通信作者：涂宗财（1965—），男，教授，博士，研究方向为食物资源的开发与高效利用。E-mail：tuzc_mail@aliyun.com