大麦皮壳率快速测定方法研究

龚强，王国荣

李博，徐延浩 主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心(长江大学)，湖北 荆州 434025；

长江大学农学院，湖北 荆州 434025

大麦皮壳率快速测定方法研究

龚强，王国荣

李博，徐延浩 主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心(长江大学)，湖北 荆州 434025；

长江大学农学院，湖北 荆州 434025

大麦皮壳率测定主要有氨水浸泡法和千粒重量法，但均不适合进行快速、高通量样品分析。纤维素是大麦皮壳的主要化学成分。采用新型纤维素溶解体系，探讨了快速、稳定和高通量测定大麦皮壳率的方法。结果表明，NaOH溶液、NaClO溶液、NaOH/尿素体系都能用于测定大麦皮壳率，但碱性次氯酸钠法效率更高。通过比较NaOH浓度、NaClO浓度以及处理时间对大麦皮壳率测定的影响，得出4%NaOH配合20%的NaClO溶液，经过2min的短沸是一个比较快速稳定的方案。比较碱性次氯酸钠法与氨水浸泡法、千粒重量法、NaOH/尿素法的准确性与重复性，发现碱性次氯酸钠法准确度高、重复性好、效率高，最适合作为快速、稳定、大批量测定大麦皮壳率的方法。

大麦；皮壳率；碱性次氯酸钠法；纤维素溶解体系

大麦皮壳率是指皮大麦籽粒的皮壳重占籽粒总重量的比例。大麦的皮壳率变化很大，占粒重的10%～20%左右。酿造啤酒用大麦要求皮重不高于8%～9%[1]。皮壳率高，不仅降低粒重影响产量，在麦熟过程中遇阴雨易感染赤霉病,而且降低籽粒品质与发芽势和发芽率[2]。皮壳中含有硅酸、花色苷、单宁和苦味物质,部分可溶性物质在糖化时溶解在麦芽汁中,氧化而成褐色,损害啤酒的色泽和风味，厚壳大麦制造的啤酒色泽深,风味不纯,并且容易混浊[3]。前人对大麦皮壳的遗传及其与其他农艺性状之间的相关性已有较多研究[1,4～7]，但关于皮壳率的分子遗传机制还未见报道。

大麦皮壳率测定方法主要有氨水浸泡法(简称SAA法)和千粒重量法。SAA法不伤种子内核，用种量少，但需要手工剥壳，费时、费工且难以完全去除种皮；千粒重量法使用的50%硫酸溶液消解种壳，去壳完全，但腐蚀性强，易导致皮壳率偏高，降低测定结果的准确性。这2种方法对大群体的皮壳率进行分析不适用，限制了皮壳率遗传QTL定位等工作的开展，需要开发一种快速、稳定且能大批量测定大麦皮壳率的方法。

大麦皮壳的化学组成主要为纤维素、半纤维素、木质素，还有少量的无机盐和花色苷、单宁等多酚物质[8]。由此可知，大麦皮壳率测定主要涉及种皮和果皮中纤维素分子的溶解问题。近年来，新型的纤维素溶解体系不断出现，传统的磷酸溶解法得到改进，并发展出低温NaOH(LiOH)/尿素体系[9]。应用新型的纤维素溶解体系去探索建立大麦皮壳率测定的方法是一个值得尝试的领域。

随着大麦分子遗传育种水平的提高，通过千粒重来负向筛选低皮壳率的方法已不能满足现代大麦育种的需求，迫切需要建立快速、稳定和高通量的皮壳率测定方法，对皮壳率的分子遗传机制进行解析，开发皮壳率相关的分子辅助选择育种标记。本研究探讨了碱性次氯酸钠和NaOH尿素体系测定大麦皮壳率的方法，综合比较氨水浸泡法、千粒重量法、碱性次氯酸钠法和NaOH尿素法测定皮壳率的准确度和精确度，提出了一种快速、稳定和高通量的皮壳率测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为大麦鄂啤2号，2015年5月收获后晾晒、除杂后置实验室保存待用。

1.2 实验方法

分别采用氨水浸泡法、千粒重法、碱性次氯酸钠法、NaOH尿素溶解法对大麦皮壳率进行测定，比较不同方法对大麦皮壳率测定结果的影响。对氨水浸泡法，比较不同浓度氨水和不同处理时间下皮壳率测定结果的差异；对碱性次氯酸钠法，比较不同处理时间、不同NaClO浓度、不同NaOH用量下皮壳率测定结果的差异，探索最优的皮壳率测定方案。

1)氨水浸泡法。参照文献[8]介绍的方法，取100粒种子置于80℃水浴条件下浸泡，设置3个时间梯度(40、60、80min)和4个氨水浓度梯度(5%、8%、12%、15%)，比较手工去壳的难易程度及皮壳率的差异。

2)千粒重法。按标准程序[8]，取15g左右麦粒于室温下在50%硫酸溶液中浸渍5h，并搅动，最后用水充分洗涤直至所有麦皮脱离，通过去皮前后的大麦千粒重量计算出皮壳率。

3)碱性次氯酸钠法。将15g左右大麦种子置于NaOH和NaClO混合液中，慢慢加热沸腾，搅拌直至皮壳完全去除，置于水中充分清洗，从而去壳。设置时间(2～6min)、NaClO浓度(10%、20%、30%、40%)、NaOH(2、3、4g)3个因素的梯度试验，探索最优的碱性次氯酸钠处理方案。

4)NaOH/尿素溶解法。参照吕昂等[10]溶解天然纤维素的方法并略作修改。将15g左右种子置于7%氢氧化钠和12%尿素水溶液中，在-10℃左右震荡处理5h，再用50℃左右温水充分冲洗，测定其皮壳率。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0对数据进行方差分析，Duncan检验进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 氨水法测定条件对大麦皮壳率测定结果的影响

实验结果表明，适当增加处理时间，基本不影响皮壳率测定结果；氨水浓度增加对皮壳率测定结果的影响也不大(表1)。方差分析结果(表2)表明不同处理时间和氨水浓度对皮壳率的影响均未达到显著水平(α=0.05)。氨水浸泡使大麦种壳松动，但还必须加以手工去壳才能测定皮壳率，这是氨水法效率不高的关键点所在。尽管氨水浓度对皮壳率测定没有影响，但实践中发现，15%的氨水处理与5%的氨水处理相比，皮壳松动效果显著提高，极大提高了手工去壳的速度，从而提高了氨水法的效率。

表1 不同氨水浓度和时间处理下测定的大麦皮壳率%

表2 不同氨水浓度和时间处理下大麦皮壳率的方差分析

注：显著水平α=0.05；NS表示无显著性差异。

2.2 碱性次氯酸钠法测定条件对大麦皮壳率测定结果的影响2.2.1 NaOH、NaClO及其混合液对大麦皮壳率测定结果的影响

NaOH和NaClO溶液加热沸腾处理都能去掉大麦的皮壳，NaOH溶液会使皮壳脱落，而NaClO溶液会使皮壳分解为絮状物，逐渐溶解。20%NaClO和2%NaOH的时间(1～6min)梯度试验表明，样品皮壳率的测定结果随着处理时间的增加而增加，1～4min皮壳率增加较快，之后皮壳率的增加较慢，但总的皮壳率水平高于氨水法(图1)。20%NaClO处理，皮壳只是部分溶解，皮壳比较厚的腹沟处去壳效果较差(图1a)；2%NaOH处理测定的皮壳率较20%NaClO高，去壳效果较好，但腹沟处仍有部分残留(图1b)。

图1 NaClO、NaOH及其组合沸腾4min溶解大麦皮壳的去壳效果

次氯酸钠在碱性条件下稳定性最好,能充分发挥其对蛋白质纤维的氧化降解作用[11]。因此，设计2%NaOH和20%、30%、40%NaClO配合测定的时间(1～6min)梯度试验。结果表明，NaOH和NaClO配合使用，提高了对大麦皮壳溶解的速度，样品的皮壳率在3～4min内趋于恒定，随后迅速上升，且高于正常的皮壳率水平(图2)。碱性次氯酸钠溶液去壳效果要优于单独使用NaOH或NaClO(图1c)。

图2 20%NaClO、2%NaOH和不同浓度NaClO配合2%NaOH处理测定的皮壳率

2.2.2 碱性次氯酸钠法测定大麦皮壳率的条件优化

图3 NaClO、NaOH和沸腾时间3因素组合处理对大麦皮壳率测定结果的影响

从图2可以看出，随着浓度的提高和时间的延长，皮壳率总体呈现先升高，后趋于稳定，最后又略微升高的趋势。同时观察发现大麦的去壳效果也越来越好，但高浓度和长时间的处理会导致大麦胚严重受损、脱落，降低实验结果的准确性。为了进一步探讨NaOH浓度、NaClO浓度和处理时间对大麦皮壳率测定结果的影响，从中选择去壳效果好且经济高效的处理，设置了NaOH浓度(2%、3%、4%)、NaClO浓度(10%、20%、30%、40%)和沸腾时间(2、3、4、5、6min)3变量的60个组合进行处理，每个处理3次重复，试验数据通过直方图统计(图3)。结果表明，不同的组合处理下，鄂啤2号的皮壳率分布在9.87%～16.75%的范围内，皮壳率主要集中在11.38%～14.39%的范围内，概率为80%。值得注意的是，皮壳率低于11.38%的样本存在部分皮壳残留，皮壳率高于14.39%的样品存在明显的籽粒糊粉层甚至是胚的受损。统计分析表明，10%～30%次氯酸钠显著影响皮壳率测定结果，而40%次氯酸溶液对皮壳率测定结果没有显著影响；NaOH浓度的变化对皮壳率测定结果的影响达到极显著差异；2min处理对皮壳率测定结果没有显著影响，其他时间处理则对皮壳率测定结果的影响达到极显著水平。

从上述试验组合中选择了20%NaClO+4%NaOH沸腾处理2min等6个去壳效果较好的皮壳率测定方案进行分析(表3)。结果表明，处理5和处理6与处理1和处理2的皮壳率相比较高，达到显著水平，但6种处理的去壳效果差别不大，都能轻松完全地去除皮壳。综合处理时间和相对标准偏差值(RSD)，得出4%NaOH配合20%的NaClO溶液，经过2min的短沸，可以作为碱性次氯酸钠法快速测定大麦皮壳率的一个通用方案。

表3 6种不同实验处理测定的皮壳率

注：min即沸腾处理时间。

2.3 NaOH尿素处理对大麦皮壳率测定结果的影响

使用NaOH尿素低温体系处理后，大麦的皮壳并不能完全自行脱落，必须使用50℃左右温水充分冲洗，皮壳才能轻松脱落。实验结果表明NaOH/尿素体系测定的皮壳率为(14.90±0.55)%。与氨水法和碱性次氯酸钠法相比，NaOH/尿素法得到的皮壳率偏高，观察发现处理后大麦的胚会受到损伤且部分溶解，这可能是测定的皮壳率较高的原因。缩短处理的时间，发现其脱壳效果较差，皮壳不能完全从籽粒上脱离。

2.4 氨水浸泡法、千粒重法、NaOH/尿素溶解法、碱性次氯酸钠法处理测定皮壳率的差异

分别用千粒重法、氨水法、碱性次氯酸钠法和NaOH/尿素溶解法对大麦皮壳率进行测定，结果表明，这4种方法测定的皮壳率大小表现为：NaOH/尿素溶解法>千粒重法>碱性次氯酸钠法>氨水浸泡法，而相对标准偏差值最大的为氨水浸泡法，最小的为千粒重法，其次为碱性次氯酸钠法。综合比较来看，次氯酸钠法最适合作为一种快速、稳定、能大批量测定大麦皮壳率的方法。

表4 千粒重法、氨水法、NaOH/尿素溶解法和碱性次氯酸钠皮壳率结果结果比较

3 讨论

千粒重法测定的皮壳率偏高，这可能是因为50%的硫酸溶液腐蚀性强，能同时溶解纤维素和木质素，长时间的处理在去除皮壳的同时会损失糊粉层和部分大麦仁。NaOH/尿素溶解法在去壳的同时对胚有损伤，这可能是测定的皮壳率偏高的原因。其次，NaOH/尿素溶解法需要在低温长时间处理，对设备要求高，耗时长，不适合大批量皮壳率的测定。碱性次氯酸钠法主要溶解纤维素，处理时间短，对大麦仁的损伤小，经过处理后大麦仍然是坚硬完整的，只要控制好时间，不同批次之间测定值比较稳定。氨水法处理过程会产生刺鼻气味，处理后种子表面仍有一层内种皮，而且腹沟的种皮不容易剥除，皮壳会有所损失，加上需要人为去壳，皮壳率精确度差，导致相对标准偏差值偏大，皮壳率也偏低。结果准确性不如千粒重法、NaClO碱液法。相对于千粒重法，碱性次氯酸钠法更适合作为大批量处理的方法。

大麦皮壳率测定主要涉及大麦皮壳的溶解问题，皮壳经氨水处理会增大皮壳的表面积和孔隙度，会部分溶解木质素，表面坚硬性质发生改变，从而可以脱壳[12]；纤维素在碱液中会生成碱性纤维素而溶解[13]。NaClO溶液中游离的Cl-与纤维素的OH-基中的H原子和O原子发生作用，分子间氢键断裂，纤维素溶解。低温下氢氧化钠水合物与纤维素上羟基通过氢键驱动自组装形成包合物，从而破坏纤维素原有的分子内和分子间氢键，最终溶解纤维素[10]。可见，纤维素溶解化学的发展是推动大麦皮壳率测定方法改进的基础。

大麦皮壳作为大麦粒重的重要组成成分，占粒重的10～20%，皮壳富含纤维素、木质素和很多微量矿物元素。Tae Hyun等[12]研究表明大麦皮壳的70%左右是可利用的糖类，可以发酵生产燃料乙醇；Bledzki[14]将大麦皮壳融入聚丙烯材料中，形成的复合材料比软木复合材料抗拉强度提高了10%，其他性能也有所提升。本研究还发现，2%的NaOH将皮大麦煮沸2min左右就能脱下大部分的皮壳而皮壳溶解较少，从而尽可能多地保留大麦皮壳，使其能在后续加工中得到充分利用。随着生物能源利用和高分子材料的兴起，大麦及其皮壳的应用将更加广泛，未来若能开发出控制皮壳基因的分子标记来辅助选择育种，将会推动大麦的饲用、啤用、食用、工业应用方向的专向育种，培育出皮壳率含量符合需要的品种。

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[编辑] 余文斌

2017-03-29

国家自然科学基金项目(31201212)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金课题(20114220120003)。

龚强(1995-)，男，硕士生，研究方向为植物分子育种。通信作者：徐延浩，xyh09@yangtzeu.edu.cn。

S512.3

A

1673-1409(2017)14-0047-05

[引著格式]龚强，王国荣，李博，等.大麦皮壳率快速测定方法研究[J].长江大学学报(自科版) ，2017，14(14)：47～51.