检测结直肠癌患者血清中长链非编码RNA-SchLAP1和DEK表达的临床意义

刘东楠，张锦辉，夏荣钧，王慧莹，张娟，殷玉龙，尹铭旋，林黎娟

（辽东学院医学院，辽宁丹东118003）

【医药与卫生】

检测结直肠癌患者血清中长链非编码RNA-SchLAP1和DEK表达的临床意义

刘东楠，张锦辉，夏荣钧，王慧莹，张娟，殷玉龙，尹铭旋，林黎娟*

（辽东学院医学院，辽宁丹东118003）

为了研究长链非编码RNA-SchLAP1在结直肠癌（CRC）患者血清中的表达及临床意义，收集CRC患者血清标本60例、健康人血清标本20例，利用RT-PCR方法检测SchLAP1和DEK的表达情况，分析二者与CRC患者临床病理学参数及生存期的相关性。结果显示，SchLAP1和DEK在CRC患者血清中的表达水平均明显高于健康人群；SchLAP1高表达率与临床分期明显相关，而DEK高表达与组织分化程度及临床分期明显相关，两种基因的高表达率经Spearmans检验具有明显相关性；SchLAP1和DEK同时高表达的患者5年生存率和无瘤生存率明显低于单独一种表达或两种均不表达者。因此，检测血清中SchLAP1和DEK基因的表达对评估CRC预后均有一定的临床意义，二者同时检测时价值更明显。

LncRNA；SchLAP1；DEK；结直肠癌；血清

我们的前期研究已经表明，DEK高表达与包括人类结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在内的多种恶性肿瘤的发生发展明显相关，可做为CRC的生物标志物用于早期诊断和预后评估[1-3]。

长链非编码RNA（LncRNA）是位于胞核或胞浆的一类长度大于200 nt的非编码RNA的总称，其表达受发育调控，具有组织和细胞特异性，近年来已成为肿瘤分子生物学研究的热点[4]。LncRNASchLAP1（Second Chromosome Locus Associated with Prostate-1）最早在前列腺癌患者中被发现呈过表达，可以做为病人预后不良（包括肿瘤的转移和前列腺癌特异性死亡）的独立风险预测指标[5]。目前，CRC相关lncRNAs及SchLAP1的研究较少[6]，它们在CRC细胞恶性演进过程中的作用需要研究者深入分析，尤其是对SchLAP1的进一步探索将为CRC预后评估和靶向治疗提供新的生物标记物。本研究旨在探讨CRC患者血清中SchLAP1和DEK表达的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2009年1月~2011年7月丹东地区经手术切除后病理学证实为CRC患者的术前血清标本60例。所有病例均有严格的随诊资料，病理参数包括年龄、性别、组织分化、淋巴结转移、CEA水平及临床分期等。患者年龄为34～71岁，中位年龄为54岁，男女比例为42∶18；根据TNM和FIGO分期，35例为早期（Ⅰ-Ⅱ）、25例为晚期（Ⅲ－Ⅳ）；根据国际抗癌联盟（UICC）第七版标准分类，15例高分化、45例为中或低分化。20位健康体检人员的血清标本也被纳入，患者手术前均未接受放、化疗。

经伦理委员会批准，80位入选者均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR（RT-PCR）

RT-PCR是由Bio-Rad序列检测系统根据制造商的指示使用双链DNA-specific SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（TaKaRa公司，日本），指示提取血清样本的总RNA。通过逆转录酶引物合成第一链cDNA（TaKaRa公司，日本）和低聚糖（dT）。PCR反应都是在20μL反应物中，以94℃变性4 min开始，进行PCR扩增23~36周期，94℃15 min和53~58℃30 sec，引物退火，并在72℃延长10 min，用3%琼脂糖凝胶进行电泳。再用Champchemi专业图像分析系统（赛智公司，中国）和LANE 1D软件对蛋白条带进行量化（赛智公司，中国）。RT-PCR反应重复三次。

1.2.2 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。CRC患者血清中SchLAP1和DEK差异表达采用t检验；SchLAP1表达与CRC患者的临床病理特征的关系采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SchLAP1和DEK在CRC患者血清中的表达及其与患者临床病理学参数的相关性

RT-PCR结果显示，SchLAP1和DEK在CRC患者血清中的表达分别4.497±1.567和3.781±1.219，均明显高于健康人（2.639±1.095和1.463±0.853）（P＜0.05）；SchLAP1在CRC血清中的高表达率为65.00%（39/60），其在晚期（Ⅲ～Ⅳ）患者血清中的高表达率明显高于早期（Ⅰ～Ⅱ）患者（P＝0.041），而DEK在CRC中的高表达率为63.33%（38/60），其中分化程度中、低的患者和晚期的患者血清中高表达率明显高于分化程度高及早期的患者（P值分别0.006和0.005）（见图1和表1）。*P＜0.05,**P＜0.01

图1 RT-PCR检测两种基因在20例健康人及60例结直肠癌患者血清标本中的表达水平（P值均＜0.05）

表1 60例CRC患者血清中SchLAP1和DEK表达与临床病理学特征的关系

续表160例CRC患者血清中SchLAP1和DEK表达与临床病理学特征的关系

2.2 SchLAP1与DEK同时高表达对患者生存期的影响

Spearman检验结果显示，两种基因的高表达存在明显相关性，P＝0.017（见表2）。

表2 Spearman检验分析60例CRC患者血清中SchLAP1表达与DEK表达之间的关系

为了进一步阐明SchLAP1与DEK同时高表达对CRC患者预后的影响，我们通过Kaplan-Meier方法进行了生存期分析。60例CRC血清标本中，两种基因同时高表达患者的5年生存率及无瘤生存率均明显低于单一基因高表达者和两种基因同时低表达者（见图2），差异均有统计学意义。

图2 Kaplam-Meier生存分析曲线

由图2 Kaplan-Meier生存分析结果显示，两种基因同时高表达患者的生存率均明显低于单一基因高表达者和两种基因同时低表达。由图2（A）可知：5年生存率，第1组与第2、3、4组相比P值分别为0.27、0.22和0.31；由图2（B）可知：无瘤生存率，第1组与第2、3、4组相比P值分别为0.27、0.16和0.26。（第1组：SchLAP1与DEK同时高表达组，共29例；第2组：SchLAP1低表达而DEK高表达组，共9例；第3组：SchLAP1高表达而DEK低表达组，共10例；第4组：SchLAP1与DEK同时低表达组，共12例）。

3 讨论

尽管有了手术切除及放、化疗等较为先进的治疗手段和技术，CRC患者5年生存率和生活质量仍未见明显改善，尤其是晚期CRC。寻找能够早期确诊的生物标志物、针对肿瘤细胞恶性进展相关基因实施的治疗措施是干预CRC肿瘤演进、降低复发和死亡率的关键[1]。

随着基因芯片和新一代高通量测序技术等的发展，lncRNA在转录组中的重要地位已测序明确。它们具有调节转录、翻译、细胞分化、基因表达调控、细胞周期调控、染色质修饰和细胞核-细胞质之间的运输等多种功能，在肿瘤形成、预后标志物作用、治疗模式风险预测等方面起着非常重要的作用[4]。因此，深入研究CRC相关lncRNAs的分子调控机制可以为早期诊断和预后评估提供有效的生物标志物和新的分子治疗靶点，为临床制定相应的治疗策略提供新思路。新兴的LncRNA-SchLAP1被命名为与前列腺-1相关的第二个染色体基因座，也称为LINC00913，是肿瘤侵袭和血行转移的重要介质。通过体外及体内功能获得和功能缺失实验表明，SchLAP1对SWI/SNF染色质修饰的基因组定位和调控产生抵抗，阻止了SWI/SNF复合物的抑癌功能、促进了癌细胞的侵袭和转移，导致致死性癌症的发展[6]。通过扰乱SWI/SNF复合物，SchLAP1可导致成百上千的基因表达的改变，促进了全面的转移级联反应，而并非通过单一的信号通路增加肿瘤的恶化风险。另外，SWI/SNF复合物与已知的肿瘤抑制基因和癌基因产物如RB、BRCA1、c-MYC和MLL之间也直接发生作用[7]。已有报导提出SWI/SNF核心元件BRG-1和催化亚单位BRMS1的缺陷可促进结CRC的扩散[8]，因此我们大胆预测SChLAP1也可能在CRC的演进中起到一定的作用。该预测在本实验结果中得到证实，即SchLAP1的确在CRC患者血清中的表达明显高于健康人，而且分期越晚的患者高表达率越高，而临床分期是被公认具有预后评估意义的临床参数，说明SChLAP1对CRC的预后评估有一定的意义。

癌基因DEK曾被我们前期研究证明在染色体重建、基因转录及细胞凋亡过程中发挥了重要的作用[1，3，9]。本次研究我们利用RT-PCR方法同时检测标本中SchLAP1与DEK的表达水平来进一步推测SchLAP1对CRC病变演进的影响，结果显示，SchLAP1的表达水平与DEK明显相关，且SchLAP1与DEK同时高表达的患者比DEK单独高表达的患者生存期更为降低，说明SchLAP1与DEK同时检测对患者的预后评估作用更强于单独检测DEK表达水平，也就间接说明SchLAP1可以作为一个潜在标志物起到对CRC预后评估以及治疗靶标的作用。

SchLAP1在CRC中高表达的作用机制尚不十分清楚。不排除其在肿瘤细胞中构成了一个未被发现的信号通路，当然，这种假设需要未来更多的研究来支持。

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（责任编辑：鞠衍清）

Clinical significance of detecting LncRNA-SchLAP1 and DEK in serum of patients with colorectal cancer

LIU Dong-nan，ZHANG Jin-hui,XIA Rong-jun，WANG Hui-ying，ZHANG Juan，YIN Yu-long，YIN Ming-xuan,LIN Li-juan

（School of Medicine，Eastern Liaoning University，Dandong 118003，China）

To study the expression and clinical significance of lncRNA-SchLAP1 in serum of patients with colorectal cancer(CRC)，the serum specimens of 60 patients with CRC and 20 healthy persons were selected. SchLAP1 and DEK expression were detected by RT-PCR method.Moreover，the correlation of the SchLAP1 and DEK with clinical pathology parameters and survival of patients were analyzed by statistical methods.The results showed that both of SchLAP1 and DEK overexpression in serum of CRCs were obviously higher than that of healthy persons.Additionally，the expression of SchLAP1 was obviously related with clinical stage of CRCs，and the expression of DEK was obviously related with differentiation and clinical stages of CRCs.By combination analysis,CRC with DEK overexpression concomitant with SchLAP1 overexpression had a significantly lower 5-year survival rate and disease-free survival rate than those without SchLAP1 overexpression.Therefore，detecting the expression of SchLAP1 and DEK in serum of CRC has certain clinical significance to evaluate prognosis.

LncRNA；SchLAP1；DEK；colorectal；prognosis

R393

A

1673-4939（2017）02-0120-05

10.14168/j.issn.1673-4939.2017.02.09

2016-12-01

辽宁省科技厅自然科学基金项目（2015020554）；辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2015189）；辽东学院省级大学生创新项目（201611779048）

刘东楠（1994-），男，辽宁铁岭人，辽东学院医学院本科生，研究方向：临床护理。

*通讯作者：林黎娟（1968-），辽宁丹东人，博士，教授，研究方向：恶性肿瘤诊断及预后标志物。