育肥猪真杆菌的分离与鉴定

(安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

育肥猪真杆菌的分离与鉴定

张乃嘉，胡 桢，吴华键，李 郁*

(安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

本试验系对自安徽某猪场发病育肥猪脓肿脾脏中分离的一株细菌，通过形态特征、培养特性、生化反应检查，致病性和药物敏感性试验，以及16SrRNA基因的扩增和序列分析进行鉴定。结果显示，分离菌为革兰氏阳性短杆状菌，在兔血琼脂平板和牛血清胰蛋白胨大豆琼脂平板有氧条件下生长良好，可致小鼠死亡，对头孢类抗生素和喹诺酮类抗菌药敏感，16SrRNA基因序列与猪真杆菌属细菌的同源性最高，在91.2%～99.4%之间，遗传进化关系密切，与猪真杆菌属细菌属于同一分类群。结果表明，分离菌为猪真杆菌。

猪真杆菌；分离培养；生化反应；16SrRNA；鉴定

棒状杆菌属(Corynebacterium)菌广泛分布于自然界，多数为非病原菌，只有少数有病原性，能引起人和动物的急性和慢性传染病。由于棒状杆菌的种类不同，各种动物和人的临诊表现也不完全相同，但一般以某些组织和器官发生化脓或干酪样的病理变化为特征。

猪棒状杆菌病是由猪棒状杆菌（Corynebacterium suis），现归入真杆菌属（Genus Eubacterium ）改称猪真杆菌（Eubacterium suis）引起的疾病，主要引起猪的膀胱炎和肾盂肾炎，有的还引起猪的化脓性肺炎、支气管炎、子宫内膜炎、多发性关节炎、骨髓炎、仔猪脐炎、皮下脓肿和乳腺脓肿等。猪真杆菌病遍布于世界各国，一年四季均可发生，虽然发病率较低，只引起小规模和个别的猪发病，但病原菌却可在任何猪群中存在、也可在猪体各部位广泛存在。我国也有该病的发生，但相关的报道甚少。

2016年7月，安徽某猪场150～160日龄的育肥猪发病，临诊表现为腹部皮肤发绀，体温高达41 ℃，有呼吸道症状，排黄色稀便，并伴有血尿症，发病率为10%，病死率达30%。剖解后可见心脏出血，心内膜潮红，肺脏出血，脾脏肿大呈深褐色，肝脏有出血点，肾脏肿大呈暗红色，被膜下有细小的黄白色化脓灶，肠壁出血，全身淋巴结肿大出血，膀胱壁增厚。通过对病原的分离鉴定和致病性试验，确定该猪场有猪真杆菌感染，并根据药敏试验筛选出敏感药物，试验结果不仅为猪真杆菌感染的流行病学调查，而且为猪场防治猪真杆菌病菌提供了重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

采自安徽某猪场病死育肥猪（150～160日龄）的内脏器官。

1.2 培养基与试剂

营养琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)购于绍兴天恒生物科技有限公司，用于配制5%兔鲜血琼脂平板、5%牛血清TSA平板和添加0.5%琼脂的TSB半固体培养基；伊红美蓝琼脂培养基（EMB）、麦康凯琼脂培养基（MAC）、鼠李糖、半乳糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、棉籽糖、枸橼酸盐、硫化氢、尿素、七叶苷、靛基质、硝酸还原、VP-MR、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶生化发酵管、抗生素药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司；小牛血清购自杭州四季青有限公司；DNA Marker DL2000、2×Taq plus PCR MasterMix、细菌基因组DNA抽提试剂盒、琼脂糖均购自天根生化科技有限公司；DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

1.3 试验动物

清洁级18～22 g雌性昆明小鼠购自安徽医科大学实验动物中心。

1.4 细菌的分离纯化

无菌采集病死猪的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏组织，分别划线接种于兔血琼脂平板和TSA平板（加5%血清），37 ℃培养24 h，观察菌落性状。挑取可疑菌落，进行纯化培养，并接种普通营养琼脂平板、EMB、MAC、TSA平板（不加血清）、TSB肉汤（加5%血清）和TSB肉汤（不加血清）中，进行培养特性鉴定。取纯培养物涂片、革兰氏染色、芽孢染色、镜检，挑取单菌落垂直穿刺接种TSB半固体培养基，观察细菌形态特征。

1.5 生化鉴定

将分离纯化的细菌接种到含5%小牛血清的TSB中，37 ℃培养18～20 h，取菌液接种微量生化反应管，于37 ℃培养24～96 h，观察记录结果。

1.6 致病性试验

将分离纯化的细菌用TSB肉汤（加5%血清）增菌培养24 h，取0.5 mL腹腔注射小鼠5只为试验组，另取5只小鼠腹腔注射等量TSB（加5%血清）为对照组。在适宜条件下隔离饲养，观察小鼠发病及死亡情况。无菌采集对照组小鼠和病死小鼠肝脏、肺脏、脾脏、肾脏组织，分别划线接种兔血琼脂平板和TSA平板（加5%血清），于37 ℃培养24 h进行细菌分离，并将新分离的细菌进行PCR检测和测序比对。

1.7 分子生物学鉴定

根据细菌16SrRNA通用引物合成扩增引物。上游引物P1﹕5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'；下游引物P 2﹕5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3'。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，预计扩增片段长度约为1 500 bp。

表1 25株猪真杆菌参考菌株的名称与来源

表2 分离菌的生化鉴定结果

将分离纯化细菌按照试剂盒说明书进行细菌基因组DNA提取，进行16SrRNA基因的PCR扩增。反应体系：总体积25μL，包括12.5μL 2×Taq plus PCR MasterMix，上下游引物(20μmol/L)各1μL，5μL模板DNA，5.5μL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃2 min，共35次循环；最后72 ℃再延伸10 min。

反应结束后，取PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在紫外灯下观察，用数字凝胶成像系统记录实验结果。切胶回收阳性PCR扩增产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。将测定的序列结果通过NCBI网站中BLAST界面，与其基因库中所有序列进行相似性比对，再应用DNAStar软件中的MegAlign程序与GenBank登录的猪真杆菌属中25个不同种的菌株（表1）的16SrRNA基因序列进行比对和同源性分析并构建遗传进化树。

1.8 药物敏感试验

选用临床上常用的头孢类（头孢曲松、头孢呋辛、头孢拉定、头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻肟）、氨基糖苷类（丁胺卡那、新霉素、卡那霉素、大观霉素）、喹诺酮类（氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星）、青霉素类（氨苄西林、青霉素）、磺胺类（甲氧氨苄嘧啶、复方新诺明）和林可胺类（林可霉素）等21种抗生素药物，采用纸片琼脂扩散法，对分离纯化的细菌进行敏感性试验。根据美国临床实验室标准委员会(CLSI/ NCCLS)2010版执行标准判定结果。

2 结果

2.1 细菌的分离纯化

在兔血琼脂平板和TSA平板（加5%血清）上，自病猪脾脏组织分离获得一株细菌。

2.2 分离菌的培养特性

分离菌在兔血琼脂平板和TSA平板（加5%血清）上形成滴露样黄色细小菌落，光滑、圆润、半透明，不完全溶血；在加血清的TSB中培养的细菌生长良好，呈均匀浑浊，无沉淀和菌膜形成；在普通营养琼脂、不加血清的TSA和TSB、EMB、MAC上不生长。显示该分离菌的生长需要血液或血清。

2.3 分离菌的形态特性

分离菌革兰染色阳性，形态多样，菌体直或微弯，大多为一端或两端膨大的杆状，单在或成栅状或成丛排列，无芽胞，无鞭毛，不运动。

2.4 分离菌的生化特性

生化试验结果表明，此分离菌能发酵蔗糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖;不能发酵棉籽糖、蕈糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖;靛基质试验、硫化氢、硝酸盐还原、M R－VP试验为阴性、不能与尿素、马尿酸、七叶苷发生反应;不能利用枸橼酸钠;接触酶阴性。见表2。

2.5 分离菌的致病性鉴定

试验组小鼠在攻毒14 h左右开始出现精神萎靡、行动迟缓并伴有腹式呼吸的症状，其中4只小鼠于30 h内死亡，1只存活；对照组小鼠均健活。剖检小鼠分离细菌，对照组各内脏器官均没有细菌生长，试验组自肝脏组织中获得细菌，经PCR检测及测序比对，证实分离菌为试验攻毒菌。

2.6 16SrRNA基因的扩增及基因同源性分析

以提取的分离菌基因组为模板，用16SrRNA上下游引物进行PCR扩增，结果扩增出一条约1 500 bp的条带，见图1。

同源性分析结果显示，分离菌与25株猪真杆菌参考菌株的同源性在91.2%～99.4%之间（表3），与C.amycolatum CIP103452同源性达99.4%；在建立的遗传进化树中，分离株与25株猪真杆菌参考菌株位于同一大的分支上，其中与C.amycolatum CIP103452位于同一个小分支上，遗传关系最为亲密（图2）；确定本次分离菌为猪真杆菌，并命名为FN株。

2.7 分离菌的药物敏感性

图1 分离菌株 PCR产物电泳鉴定结果

表3 16SrRNA基因序列同源性分析%

图2 基于16Sr R NA基因序列的系统进化树

分离菌对丁胺卡那、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄西林、氧氟沙星、头孢拉定、头孢唑啉、头孢氨苄、恩诺沙星、头孢噻肟等10种药物敏感；对青霉素、环丙沙星、新霉素等3种药物中度敏感；对卡那霉素、林可霉素、大观霉素、甲氧氨苄嘧啶、复方新诺明等其他8种药物均耐药。

3 讨论

棒状杆菌广泛分布于动物机体、环境、水体和食品等中，属于条件致病性病原菌。报道显示，多种医学相关的棒状杆菌都是人类皮肤常在菌群之一，其中部分棒状杆菌具有广泛的耐药性，并且能引起严重的乃至致命性疾病，尤其对免疫抑制的病人危害更重。因此，对棒状杆菌致病性的研究越来越引起广泛关注[1]。猪棒状杆菌即猪真杆菌是定殖于上呼吸道、生殖道的常在菌，约有80%健康猪正常带菌，正常情况下并不会引起猪体发病，但在母猪生产时，由于胎儿的挤压或人工助产则易导致生殖道黏膜损伤，定殖的猪真杆菌即可在受损黏膜处大量繁殖并分泌毒素从而引发炎症。所以引起猪的真杆菌病主要集中在生殖道和呼吸道，由这些部位分离到真杆菌均有相关报道[1-3]，而从其他部位分离到猪真杆菌的则尚未见报道。此外当机体抵抗力下降，或感染猪圆环病毒2型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等免疫抑制性疾病病原，或黏膜损伤后，也容易继发感染细菌。棒状杆菌能引起犊牛、绵羊、波尔山羊、广西黑山羊、猪、柴达木双峰驼、林麝、鼠等多种动物发病，导致发病动物肺脏大面积肉变并形成化脓结节灶，肺门淋巴结水肿，脾脏表面有出血点，肝脏肿大，肾脏表面大量出血[4-7]。

本试验针对安徽某猪场150～160日龄育肥猪出现的病情，首先进行发病情况的了解、临诊症状和病理变化的观察，然后采取病料组织进行细菌分离培养、相关病毒检测，利用形态与染色、培养与生化特性、动物致病性试验等常规病原菌鉴定方法，最终通过16SrRNA基因的扩增及基因同源性分析，确定该发病育肥猪的病原菌为猪真杆菌，尤其值得关注的是病原分离菌源自脾脏组织。传统的细菌鉴定方法项目繁多且持续周期长，常不能满足兽医临床对疾病诊断和病原鉴定的快速需求，而PCR技术则因其特异性强、灵敏度高、简便、快速的特点得到了广泛应用。16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，其保守区能反映生物物种的亲缘关系，可变区具有揭示生物物种的核酸序列特征。目前16SrRNA序列分析是对细菌进行分类学研究中较精确的一种技术，16SrRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。

筛选出丁胺卡那、头孢曲松、头孢呋辛、氨苄西林、氧氟沙星、头孢拉定、头孢唑啉、头孢氨苄、恩诺沙星、头孢噻肟等10种抗菌药物，可作为本次育肥猪真杆菌感染的首选治疗药物，可见该分离菌主要对头孢类和喹诺酮类敏感，这与已报道的广西株（1999年）[2]、四川SCYAN1株（2010年）[5]、广西GX-A株（2016年）[8]等的药敏结果不完全一致，显示出时间上和地域性差异。不同地区、不同养猪场，即使同一养猪场在不同的时间，其用药方法都会存在一定的区别，从而导致猪真杆菌分离菌对药物敏感性的不同。此外，已有报道，一些地区虽然根据药敏试验结果筛选出多种高敏的抗猪真杆菌药物，但对感染后期患猪的治疗效果却不佳，原因是猪真杆菌在感染部位形成了厚包囊，导致药物不能进入抑制或杀灭细菌。因此，对于猪真杆菌感染的防治，一是要早治疗，二是要对尚未出现症状的猪群进行药物预防，才能达到有效的防治效果。通过病因确定、防治方案制定与实施，安徽某猪场育肥猪群的病情得到了有效控制并转归。

［1］ LAGROU K,VERHAEGEN J,et al.Prospective study of catalaseposi-tive coryneform organisms in clinical specimens﹕identificatio n,clinical relevance,and antibiotic susceptibility［J］.Diagn Microbiol Infect Dis,1998,30,7-15.

［2］ 邓绍基，骆永泉．母猪产后发生化脓性棒状杆菌病诊疗报告［J］．贵州畜牧兽医，1999(4)﹕22-23.

［3］ 李冰，刘孝刚，付纯强，等．猪棒状杆菌感染的诊治研究［J］．中国畜牧兽医，2007，34(4)﹕125-126.

［4］ 范承祥，秦绪志，李宜华，等．猪棒状杆菌感染的诊治［J］．中国兽医杂志，2001(11)﹕44.

［5］ 李敏，田明星，邹年莉，等．一株猪源棒状杆菌的分离及其16Sr R NA基因分析鉴定［J］．中国畜牧兽医，2010，37(10)﹕77-80．

［6］ 郑敏，胡杰，欧绍毅，等．广西黑山羊伪结核棒状杆菌的分离与鉴定［J］．广西农业科学，2010，41(10)﹕1128-1130.

［7］ 肖林晋，孙延鸣．犊牛棒状杆菌的分离鉴定［J］．畜牧与兽医，2012，44(9)﹕79-81.

［8］ 秦毅斌，何苹萍，卢冰霞，等．猪源棒状杆菌的分离及其16Sr R NA基因分析［J］．畜牧与兽医，2016，48(3)﹕95-99．

2017-03-15）

国家星火计划重点项目(2014GA710002)；安徽省质量工程项目(2013sxzx008)；安徽农业大学大学生创新基金项目(XJ2015093)；安徽省生猪产业体系基金

张乃嘉(1991-), 女，山东烟台人，硕士研究生，主要从事动物传染病学研究

*通信作者：E-mail：liyouer@163.com