猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法的建立

孔园园，邸晶美，罗尚星，刘宝京，范京惠，左玉柱

（河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001）

猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法的建立

孔园园，邸晶美，罗尚星，刘宝京，范京惠，左玉柱*

（河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001）

本实验将构建的重组表达质粒pET-32a（+）-S798转入大肠杆菌中诱导表达，获得表达量较高的包涵体蛋白。以纯化的S重组蛋白作为包被抗原，初步建立了母猪乳汁中IgA抗体的间接ELISA检测方法。抗原包被浓度为0.938 ug/mL，乳汁稀释度为1:320，对反应条件进行优化，批内批间重复性试验变异系数均小于10%，与市售试剂盒相比特异性为90%、敏感性为94%、符合率为92%，本方法具有良好的特异性和敏感性，可以对猪乳汁中抗流行性腹泻病毒的IgA抗体水平进行快速检测。

猪流行性腹泻病毒；S蛋白；ELISA；IgA

猪流行性腹泻（PED）是猪的一种急性、高度传染性消化道疾病，由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起。主要危害哺乳仔猪，临床表现为呕吐、水样腹泻和脱水死亡等症状[1]，使仔猪存活率显著降低，给养猪业带来巨大经济损失[2]。哺乳仔猪通过乳汁免疫获得母源抗体sIgA，sIgA能够抑制PEDV在肠道上皮细胞进行附着和繁殖，保护仔猪小肠上皮细胞，阻止PEDV侵入机体[3]。关于被动乳汁免疫，近期研究表明接受母源抗体的仔猪、保育猪的粪便中PEDV RNA载量明显减少；母猪乳汁IgA抗体水平高，其所产仔猪粪便中PEDV RNA载量相对就低[4]。IgA抗体才是真正反应黏膜免疫保护的重要指标，因此需要建立一种合理、快速的方法对免疫母猪乳汁中IgA抗体水平进行检测。S蛋白是位于PEDV表面的纤突糖蛋白，含有主要抗原决定簇，诱导机体产生中和抗体[5]。本实验扩增S蛋白基因优势抗原表位区，将其转入BL21（DE3）中诱导表达，以纯化的S重组蛋白作为包被抗原，建立了针对乳汁中IgA抗体的间接ELISA检测方法。

1 材料

1.1 抗原与乳汁

抗原：纯化的S重组蛋白；PEDV阴阳性乳汁：由本实验室保存。

1.2 抗体及其他实验材料

辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗猪IgA：购自Abcam公司；96孔酶标板、TMB单组份显色液：购自Solarbio公司，PEDV-IgA ELISA试剂盒，购自上海东鸽生物技术有限公司。

2 方法

2.1 抗原、一抗最佳稀释浓度的确定

纯化好的蛋白用包被液梯度稀释，包被浓度依次为3.750 μg/ mL、1.875 μg/mL、0.938 μg/ mL、0.469 μg/mL、0.236μg/mL、0.117 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃过夜包被。用PBST洗涤3次，每次约3 min，用力拍干；加入含5 % 胎牛血清的PBST，150 μL/孔，37 ℃封闭1 h；弃去封闭液，拍干，然后用抗体稀释液将阴、阳性乳汁按照1∶40、1∶80、1∶160、1∶320进行倍比稀释，100 μL/孔，37 ℃作用1 h；PBST洗涤3次，拍干，每孔加入 1∶50 000稀释的HRP-山羊抗猪IgA100 μL/孔，37 ℃作用45 min；洗涤3次，用力拍干，加入TMB单组份显色液，100 μL/孔，室温避光作用10 min；加入浓H2SO450 μL/孔；酶标仪测各反应孔OD450nm值。选择阳性乳汁OD450nm值近似于1.0，阳性乳汁OD450nm值/阴性乳汁OD450nm值（P/ N）比值最大时抗原、一抗稀释度作为最佳工作条件的标准（各反应条件共同标准）。

2.2 包被条件的确定

第1组：4 ℃包被过夜；第2组：37 ℃孵育2 h；第3组：37 ℃孵育2 h后4 ℃包被过夜；第4组：37 ℃孵育2 h后4 ℃ 36 h。

2.3 封闭液的确定分别选择含5% 脱脂奶粉、5%新牛血清、1%BSA及5%胎牛血清的PBST作为封闭液进行ELISA操作。

2.4 封闭时间的确定

选择最适宜的封闭液于37 ℃分别封闭30 min、60 min、90 min、120 min。

2.5 一抗最佳作用时间的确定

加入最适浓度一抗于37 ℃条件下分别作用30 min、45 min、60 min、90 min。

2.6 酶标二抗最佳作用浓度的确定

将HRP-山羊抗猪IgA分别进行1﹕25 000、1﹕50 000、1﹕100 000 梯度稀释，37 ℃作用45 min。

2.7 酶标二抗作用时间的确定

加入适宜浓度于37 ℃条件下分别作用45 min、60 min、90 min、120 min。

2.8 底物显色时间的确定

TMB室温避光分别作用10 min、15 min、20 min、25 min。

表1 重组蛋白方阵试验

表2 批内重复试验

表3 批间重复试验

表4 与ELISA检测试剂盒比较试验

表5 建立的ELISA方法对乳汁样品的检测

2.9 阴阳性临界值的确定

用建立的ELISA方法对30份阴性乳汁进行检测，计算出30份阴性乳汁OD450nm值的平均值(X)和标准方差(SD)。样品OD450nm值≥X+3×SD为阳性；OD450nm值

2.10 重复性试验

随机选5份乳汁在同一块酶标板上进行操作，每份重复5个孔；同样的5份乳汁分别在3块酶标板进行上操作，分别计算批内、间变异系数。

2.11 与试剂盒比较

用建立的ELISA方法和市售ELISA试剂盒对62份临床乳汁样品分别进行检测，对两种方法进行比较。

2.12 临床样品的检测

应用建立的ELISA方法对临床母猪乳汁样品进行检测。

3 结果

3.1 间接ELISA方法最佳反应条件的优化

抗原最佳包被浓度为0.938μg/ mL，一抗最佳稀释倍数为1∶320（表1），包被条件为4 ℃过夜包被，封闭液为含5 % 胎牛血清的PBST，封闭时间为60 min，一抗反应时间为60 min，酶标二抗稀释浓度为1∶50 000，作用时间为45 min，底物显色时间为10 min。

3.2 阴阳性临界值的确定

30份阴性乳汁平均OD450nm值（AV）为0.144，OD450nm值的标准方差（SD）为0.049。OD450nm均值（X）+ 3 × SD = 0.264，OD450nm均值（X）+ 2 × SD = 0.224。乳汁OD450nm值 ≥ 0.268为阳性；OD450nm值< 0.227为阴性，界于两者之间判定为可疑。

3.3 重复性试验

由表2、表3可知，批内、批间重复试验变异系数平均值分别为4.48%、4.74%，均不超过10%，说明建立的ELISA方法具有良好的重复性和稳定性。

3.4 与试剂盒比较结果

由表4可知，与市售试剂盒相比，建立的间接ELISA方法特异性为90%，敏感性为94%，符合率为92%。

3.5 临床乳汁样品检测

由表5可知，所检测68份乳汁样品抗体阳性率为58.33%，对所产仔猪粪便进行病原检测，大多数为阴性，少部分阳性可能是由于母源抗体水平低等原因引起；抗体阴性率为50%，对发病仔猪粪便进行病原检测，大多数为阳性，个别为阴性，说明IgA抗体对仔猪肠道黏膜的保护性作用，IgA抗体水平可以反应黏膜免疫情况。

4 讨论

乳汁中IgA抗体数量多，且IgA不会被蛋白酶分解，可以维持自身在胃肠道的稳定性[6]。母猪免疫猪流行性腹泻疫苗尤其是口服疫苗，口服疫苗刺激母猪所产生的IgA数量要比肌肉注射途径多。检测乳汁IgA抗体可以对疫苗免疫效力进行评价进而分析对仔猪的免疫保护力。检测母猪血清IgG抗体不能全面地反应疫苗免疫效力与保护率，尤其口服疫苗时。应用已建立的间接ELISA方法对母猪乳汁进行检测，结果发现母猪乳汁中IgA抗体水平高，仔猪发病率就会降低，反之发病率会增加，说明本方法能够反应乳汁中IgA抗体水平对仔猪的免疫保护情况，为PEDV IgA抗体水平监测、疫苗免疫效力评估奠定基础。

[1] 邓芳. 猪流行性腹泻预防及诊断研究进展[J].畜禽业,2015 (3) ﹕19-20.

[2] 牛俊超,黄复深,胡佩佩.猪流行性腹泻研究进展[J].动物医学进展,2014,35(10)﹕107-110.

[3] SUN R Q,CAI R J,CHEN Y Q,et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets,China[J]. Emerg Infect Dis,2012,18(1)﹕161.

[4] 华耀,王玮,李郁,等.猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立[J].微生物学通报,2016,43(2)﹕434-443.

[5] 索延乐,卫春晓,李天丽,等.猪流行性腹泻病毒研究进展[J].当代畜禽养殖业,2015,2(3)﹕6.

[6] 孟琼,孔宁,单同领,等.猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立[J].中国动物传染病学报,2016,24(4)﹕7-12.

2017-04-27）

河北省自然科学基金项目：C2015204121