H7N9流感紧急流行病学调查中发现病毒抽样方案的制定与体会

田召芳，李春蕾，党安坤，兰邹然

（1. 烟台市动物疫病预防与控制中心，山东烟台 264000；2. 山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南 250022）

H7N9流感紧急流行病学调查中发现病毒抽样方案的制定与体会

田召芳1，李春蕾1，党安坤2，兰邹然2

（1. 烟台市动物疫病预防与控制中心，山东烟台 264000；2. 山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南 250022）

对于全面掌握禽间H7N9流感感染状况来说，开展紧急流行病学调查时发现病毒的抽样方案设计相当重要。制定方案的步骤包括：明确抽样方案设计目的、确定研究方法和抽样原则、设计抽样方案（计算群体抽样数量、场群的随机选择、场内抽样数量的计算等）、方案实施、数据收集整理和分析等。在方案制定过程中充分体会到了兽医流行病学技术的重要性。

H7N9流感；紧急流行病学调查；抽样方案；流行病学

自2013年人间出现了H7N9流感感染病例以来，人H7N9流感已经历了4个流行季，呈现周期性发展[1]。由于该病毒易于重组和变异，卫生部门担心该病毒可能会重组和变异为在人和人之间传播的毒株，从而导致在人间的大流行。这种担心有其理论依据[2]。而对于禽类，自2013年在活禽市场中监测到H7N9流感病毒后，兽医科学家们就担心这种病毒会朝着对禽类高致病性的毒株进化。一旦出现高致病性毒株，将对禽类的防控产生巨大的压力，产生的危害和困难将是难以估计的。2017年高致病性H7N9流感病毒开始出现，并在湖南、河南、河北和天津等地引起了高致病性疫情的暴发[3]。不管是出现人间H7N9流感病例，或是暴发家禽疫情，还是在实验室发现该病毒病原学阳性情况，兽医部门都需要开展紧急流感病学调查。其中，制定发现该病毒在各家禽场点分布的抽样方案，对于证明区域内是否存在该病的感染非常重要。本文结合近年来的工作，介绍H7N9流感紧急流行病学调查中发现病毒抽样方案设计及体会，希望能给一线的兽医工作者在处理类似工作时提供参考。

1 抽样方案制定及实施

参考农业部印发的《动物H7N9流感紧急监测方案》和《动物H7N9流感应急处置指南（试行）》[2]，针对县级层面出现人间H7N9流感病例，或监测发现家禽H7N9病原学阳性情况时，为了发现更多感染的家禽和了解病原的分布，对该县所在市开展发现H7N9流感病毒的抽样方案设计，大致需要开展以下工作：其一，确定抽样方案设计目的；其二，确定研究方法和抽样原则；其三，设计抽样方案；其四，方案实施；最后，数据的收集、整理和分析，为紧急流行病学调查提供数据支持。

1.1 确定抽样方案设计目的

掌握该市H7N9流感的存在和分布情况。

1.2 确定研究方法和抽样原则

1.2.1 研究方法。调查主要通过横断面研究方法实现，通过现场询问、填写调查表与抽样监测的方式进行。

1.2.2 抽样原则。抽样原则包括以下几点：第一，场点选择应遵循随机抽样原则，参考农业部《动物H7N9流感紧急监测方案》和《动物H7N9应急处置指南》要求，对不同监测区有所侧重。将出现人间H7N9流感病例，或监测发现家禽H7N9病原学阳性的县区作为核心区；与核心区相邻的县区作为重点监测区；该市其他区域作为一般监测区。第二，抽取的场点应包含种禽场、商品场、活禽市场、家禽屠宰场、野鸟栖息地等，所有活禽市场、屠宰场和野鸟栖息地均应被选择为抽样场。第三，样品应涵盖区域内的所有家禽类和野生鸟类。第四，家禽场内，按系统随机抽样要求进行随机抽样。

1.3 设计抽样方案

1.3.1 群体抽样数量的计算。用发现疫病的方法[3]来计算要抽取的场群样本量，公式为：按预期场群流行率2%，置信水平95%，检测方法敏感性100%，整个市抽样框假设为无穷大，来计算整个市的采样场点数量，应随机监测的场点数量不低于149个（也可用Win episcope、Epi info，以及中国动物卫生与流行病学中心提供的计算样本量的Excel工具等流行病学抽样软件[4]进行抽样量计算）。考虑到核心区、重点监测区和一般监测区抽样数量有别，可以适当加大核心区和重点监测区的抽样比例和抽样数量。根据农业部《动物H7N9流感紧急监测方案》和《动物H7N9应急处置指南》要求，核心监测区每个县（市、区）至少应采集30个家禽养殖场（村），重点监测区至少采集20个家禽养殖场（村），一般监测区至少采集10个家禽养殖场（村）。以烟台市为例，比如开发区出现H7N9人间病例，则该区就是核心监测区，周边的蓬莱市、芝罘区和福山区为重点监测区，其他市区为一般监测区，其实际抽样场点数量分配见表1。

表1 烟台市各县（市、区）抽样场点数量分配（单位：个）

1.3.2 场群的随机选择。因为所有活禽市场、屠宰场和野鸟栖息地均应纳入抽样范围，这样需要进行场群选择的只有家禽养殖场。各县（区）可根据各自的养殖禽场列表（抽样框），按照系统随机抽样方法，选出所要抽取的养禽场。例如，某县是一般监测区，有家禽场100个，按照要求一般监测区需要抽取10个，那么用系统随机抽样方法，等距离每间隔9个场选取1个作为抽样场，即可选出10个家禽场。

1.3.3 场内抽样数量的计算。由于流感属于空气传播疫病，病毒一旦进入非免疫禽群，传播速度会比较快，因此在场内进行样本量计算时，可以考虑使用较大的预期流行率，比如10%。那么按上述发现疫病的样本量计算公式，每个场点按照群内流行率10%，置信水平95%，检测方法敏感性100%，预计每个场点的最大采集样品数为30 份。如果数量不够30份，则按实际数量采集。

1.3.4 活禽市场、屠宰场和野鸟栖息地样品的采集。对于活禽市场、屠宰场，除了采集活禽样本外，还应采集污水沟、笼子、料槽和案板等环境样本；对于野鸟栖息地，如果能捕捉到野鸟，可采集野鸟的血液、咽喉/泄殖腔拭子以及新鲜粪便。如果无法捕捉野鸟，就采集新鲜的野鸟粪便。

1.4 方案的实施

根据方案开展调查、抽样，样本送实验室开展检测。血清学检测采用血凝抑制（HI）试验。检测血清中H7亚型流感抗体的具体操作参照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936—2003），HI抗体水平≥24，判定为阳性。病原学检测采用通用RT-PCR或荧光RT-PCR检测方法，对阳性样品再用农业部推荐的H7亚型流感RT-PCR或荧光RT-PCR进行确认。

1.5 数据的收集、整理和分析

收集调查问卷和实验室检测结果，进行统计分析，为紧急流行病学调查提供数据支持。

2 体会

2.1 兽医流行病学技术的应用使调查工作信心倍增

近年来，随着FAO、EU、OIE等对我国兽医流行病学技术援助的增加，农业部兽医局对兽医流行病学技术应用的推动速度在加快。在中国动物卫生与流行病学中心的组织下，兽医现场流行病学培训班已经成功举办了3期，第4期正在进行中，兽医流行病学技术培训的应用正在逐步展开。原有的缺乏兽医流行病学技术支持的动物疫病监测方案开始受到质疑，因监测目标不明确、抽样设计无依据、样本缺乏代表性等，更让大家对监测结果缺乏信心。本文介绍的H7N9流感紧急流行病学调查方案，在设计时采用了兽医流行病学技术，不管是抽样场数，还是场内抽样数量，都是按照流行病学抽样公式进行计算的。这既保证了抽取的样本量能满足发现疫病的要求，也能保证样本的代表性。通过这种方案的设计和实施，最终保证了调查结果较高的可信度，增强了调查工作的信心。

2.2 进行抽样方案设计时应兼顾科学性和政策性

在进行抽样方案设计时，既要考虑方案的科学性，保证设计方案的样本量能实现调查目的，抽取的样本能保证结果的准确性和精确性，使调查结果具有较高的可信度，又要兼顾国家政策及规定，保证样本能满足国家政策及规定的要求，不至于违背相关规定，在调查过程中出现政策性失误。因此，抽样数量应就高不就低，尽量同时满足两方面的要求。

2.3 在抽样设计时预期流行率的确定相当重要

用发现疫病的方法进行样本量计算时，需要考虑4个参数，即疾病预期流行率、置信水平、群体大小和检测方法敏感性。其中，置信水平通常设定为95%，检测方法敏感性根据方法来确定，是个常量，群体大小也是常量，不能确定的只有预期流行率，因此确定预期流行率显得异常重要。如果设定过低，则需要抽取的样本量就会很大；如果设定过高，抽样量就会很少，可能检测不到阳性结果。这是一对矛盾，需要用一定的知识和经验去平衡。对于禽流感非免疫群体，一旦病毒入侵，通常会有较高的感染率，因此在确定预期个体流行率时可以设置较高数值。但是，如果在人间刚发现有个别病例，那么在禽间通常不会有太高的感染率，在进行群体抽样数量计算时，可将群体预期流行率设置在比较低的水平，以抽取更多的群体。然而国家目前正在推出H7N9流感的强制免疫。一旦对禽群进行了疫苗免疫，那么由于抗体的产生，该病毒即使入侵，也不会在免疫群体中造成较高的感染率，病毒在群间的传播会受到阻隔。因此，一旦开始免疫，在开展H7N9流感调查时，预期群间流行率和群内个体流行率将都要调整到更低水平，从而检测到更多的群体和群内个体，这样才能真正发现病原感染。

[1] 王琦梅，刘社兰，陈恩富. 人感染H7N9禽流感流行病学研究进展[J]. 中华预防医学杂志，2017，51（2）：183-187.

[2] ALEXANDER D J. A review of avian inf l uenza in different bird species[J]. Vet Microbiol，2000，74（1/2）：3-13.

[3] OIE. WAHIS[DB/OL].[2017-05-31]. http://www. oie.int/wahis_2/public%5C.%5Ctemp%5Creports/en_ fup_0000023870_20170529_175922.pdf.

[4] 农业部. 关于印发《动物H7N9禽流感紧急监测方案》和《动物H7N9禽流感应急处置指南（试行）》的通知：农医发〔2013〕13号[A]. 北京：农业部，2013.

[5] CANNON R M. Sense and sensitivity--designing surveys based on an imperfect test[J]. Prev Vet Med，2001，49（3/4）：141-163.

[6] 沈朝建，王幼明. 兽医流行病学调查与监测抽样技术手册[M]. 北京：中国农业出版社，2013.

（责任编辑：朱迪国）

Development of Sampling Program for Finding out Virus in H7N9 Inf l uenza Emergency Investigation

Tian Zhaofang1，Li Chunlei1，Dang Ankun2，Lan Zouran2
（1. Center for Animal Disease Control of Yantai City，Yantai，Shandong 264000；2. Shandong Provincial Center for Animal Disease Control，Jinan，Shandong 250022）

For recognizing the infectious status of H7N9 inf l uenza in poultry，it is particularly important to develop a sampling program for fi nding out virus in emergency epidemiological investigation. There were several steps to develop the program，including determining the purpose of samping program design，determinating the research methods and sampling principles，designing the sampling programs（calculating the number of sampling farms，random selection of farms，calculation of the sampling poultries within the selected farms，etc.），the implementation of program，collection and analysis of the data and so on. The importance of veterinary epidemiology was fully realized in the process of investigation program design.

H7N9 inf l uenza；emergency investigation；sampling program；epidemiology

S851.3

：A

：1005-944X（2017）07-0025-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.007

山东省科技发展计划项目（2015GNC10027）

兰邹然