鲤疱疹病毒3型焦磷酸测序检测方法的建立

郑树城， 王 庆， 李莹莹， 曾伟伟， 王英英， 刘 春， 石存斌

(1． 中国水产科学研究院 珠江水产研究所 农业部渔药创制重点实验室 广东省水产动物免疫技术重点实验室， 广州 510380； 2．上海海洋大学 水产与生命学院， 上海 201306)

鲤疱疹病毒3型焦磷酸测序检测方法的建立

郑树城1,2， 王 庆1， 李莹莹1， 曾伟伟1， 王英英1， 刘 春1， 石存斌1

(1． 中国水产科学研究院 珠江水产研究所 农业部渔药创制重点实验室 广东省水产动物免疫技术重点实验室， 广州 510380； 2．上海海洋大学 水产与生命学院， 上海 201306)

为了针对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)建立一种基于焦磷酸测序技术的高通量、自动化、快速的检测方法，根据CyHV-3ORF55、ORF79和ORF92基因保守区域设计特异性PCR扩增引物和测序引物，进行PCR扩增筛选扩增效率最高的引物。PCR灵敏性和特异性试验结果显示，针对ORF79设计的引物扩增效率最高，最低检测量为100个拷贝数，且能特异性识别CyHV-3；将PCR产物进行焦磷酸测序，获得的序列经BLAST比对显示与CyHV-3-U、I、J和GZ11分离株一致性均为100%。该检测方法方便快速，适用于出入境口岸大批量样品CyHV-3诊断检测。

鲤疱疹病毒3型；锦鲤疱疹病毒；焦磷酸测序；检测

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)，又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)、鲤鱼间质性肾炎及鳃坏死病毒(Carp interstitial nephritis and gill necrosis virus, CNGV)，是引起鲤鱼和锦鲤高度传染性锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus disease, KHVD)的病原[1-3]。该病一般发病于春秋季节，发病温度为18℃～28℃，患病鱼常出现食欲不振、两眼凹陷、体色发黑、腹腔和鳃出血、鳃发白、皮肤出现白色斑点、黏液分泌过多等症状[4-5]。该病自从1997年在德国首次报道以来，全球多个国家报道了由鲤疱疹病毒3型引起的鲤鱼或锦鲤大量死亡的现象[6-7]。2002年，中国首次从进口锦鲤中检测到该病毒，此后华南、东北等地区相继有锦鲤疱疹病毒病暴发的报道[8-11]。锦鲤疱疹病毒病具有很高的发病率和死亡率，给鲤鱼及锦鲤养殖业造成了严重的经济损失。因此，及时对CyHV-3进行检测诊断有利于遏制疾病进一步扩散。

目前，CyHV-3的检测诊断方法主要包括细胞培养病毒分离、分子生物学方法[12-14](PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术)、酶联免疫吸附剂试验[15](Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等等。近年来，随着生物技术的高速发展，不少学者尝试应用其他更加便捷的技术对CyHV-3进行诊断检测[16-18]。其中，备受青睐的焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)具有很高的应用价值。焦磷酸测序技术是1987年建立的一项二代DNA测序技术[19-20]。因其具有高通量、敏感快速、实时检测、无须电泳及不需要荧光标记等特点在微生物鉴定分型、单核苷酸多态性和DNA甲基化等研究中受到越来越广泛的应用。本文通过对CyHV-3ORF55、ORF79和ORF92 3个基因保守区域设计特异性扩增引物和测序引物，筛选最佳扩增引物建立焦磷酸测序检测方法，拟为CyHV-3实验室的诊断尤其是口岸检疫提供一种快速准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

鲤疱疹病毒3型由本实验室分离；鲤春病毒血症病毒、大口黑鲈虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、鲤疱疹病毒2型、草鱼呼肠孤病毒由本实验保存。

1.1.2 菌株与质粒

大肠杆菌E.coliDH5α由本实验室制备；质粒pMD18-T购自宝生物工程(大连) 有限公司。

1.1.3 主要试剂

DNA及RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自Omega公司；rTaq酶购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据NCBI登录的KHV全基因组信息(DQ657948、DQ177346、AP008984)查找编码DNA聚合酶基因(ORF79)、胸苷激酶基因(ORF55)和主要衣壳蛋白基因(ORF92)的保守区域，运用焦磷酸测序检测系统PSQ Assay Design 2.0软件分析，设计扩增引物和测序引物(表1)。引物由上海生工生物公司合成。

1.2.2 PCR扩增及阳性质粒构建

基因组提取按试剂盒说明书进行。PCR体系：10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L引物各2 μL，rTaq(5 U/μL) 0.5 μL，模板4 μL，补灭菌水至50 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，50个循环；72 ℃再延伸7 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 本实验用到的引物序列

将扩增目的片段纯化回收后，与pMD18-T 载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定并由上海生工生物公司完成测序。提取阳性质粒并测定DNA浓度，换算为拷贝数后进行10倍梯度稀释，分析PCR扩增最低拷贝量。

1.2.3 焦磷酸测序

焦磷酸测序服务由北京六合华大基因科技有限公司提供。在96孔PCR反应板中加入反应结合珠2 μL，结合缓冲液38 μL，PCR产物40 μL，室温下充分混匀10 min。开启真空泵吸取结合珠及PCR产物混悬液，依次浸入70% 乙醇、0.2 mol/L NaOH和冲洗缓冲液中各5 s；关闭真空泵，后将探头上结合珠及PCR产物置入40 μL退火缓冲液(含测序引物1.5 μL)，85℃变性2 min，冷却至室温，使引物与模板退火杂交。根据Pyrosequencing软件序列设计信息计算出剂量，在试剂舱中依次加入底物混合物、酶混合物及4种dNTP(QIAGEN)，将试剂舱及96孔反应板放入Pyrosequencing检测仪(PyroMark Q96 ID，QIAGEN)进行反应，Pyro Q-CpG软件自动分析并输出测序序列。

1.2.4 PCR特异性分析

以鲤疱疹病毒2型、大口黑鲈虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒DNA及草鱼呼肠孤病毒、鲤春病毒血症病毒反转录cDNA为模板，进行PCR特异性检测。

2 结果

2.1 PCR扩增及灵敏度分析

分别应用设计的ORF79、ORF55和ORF92基因特异性引物，对10倍梯度稀释的阳性质粒进行PCR分析(图1)，3对引物均扩增出与预期大小相符的单一条带，最低检测拷贝数分别是102copies/μL、103copies/μL 和104copies/μL，说明ORF79引物扩增效率最高，该基因将作为靶基因进行后续的焦磷酸测序。

2.2 特异性检测

以多种不同的鱼类病毒为模板应用ORF79扩增引物进行PCR扩增，结果显示只有以鲤疱疹病毒3型作为模板能扩增出目的条带(图2)，表明本实验所设计的ORF79扩增引物具有较高的特异性。

图1 3对引物的PCR扩增电泳图

Fig 1 PCR amplification with three pairs of primers

1～8: 分别为107copies/μL～1 copies/μL 阳性质粒; 9：阴性对照, 未感染CyHV-3的锦鲤吻端细胞(KS); M：DL 1000 DNA Marker

图2 ORF79扩增特异性检测

1：鲤疱疹病毒3型；2：阴性对照；3：鲤疱疹病毒2型；4：鲤春病毒血症病毒；5：大口黑鲈虹彩病毒；6：草鱼呼肠孤病毒；7：传染性脾肾坏死病毒； M: DL 1000 DNA Marker

图3 焦磷酸测序结果

Fig 3 Results of pyrosequencing

2.3 焦磷酸测序

将ORF79基因引物扩增的PCR产物进行焦磷酸测序，测序峰图显示序列为：CCGCTTCGAGACCTACACGGCGTCTAGCCTCAACC(图3)，BLAST比对显示与KHV-U、I、J、GZ11分离株一致性均为100%，说明该基因能特异识别CyHV-3。

3 讨论

锦鲤疱疹病毒病自从1997年在欧洲暴发以来，迅速在全世界多个国家传播流行，范围覆盖亚洲、北美洲和非洲等多个国家和地区，对鲤鱼及锦鲤养殖业造成毁灭性打击。作为一种颇受大众喜爱的观赏鱼品种，携带CyHV-3的锦鲤有可能借助国际贸易和展览销售继续成为CyHV-3传播的源头。中国于2002年首次在进口锦鲤中检测到CyHV-3，之后多个地区出现由CyHV-3感染引起的鲤鱼或锦鲤大面积死亡现象，并分离到了包括亚洲型、欧洲型在内的病毒株[8-21]。同样，欧洲地区也曾分离到亚洲型的毒株[22]。这种不同基因型的病毒株在不同地区相互输入的现象提示我国出入境口岸及检验检疫相关部门不得不提高对CyHV-3检测诊断的意识。因此，为准确快速地对CyHV-3进行检测，建立一种适用于出入境口岸诊断的高通量、自动化、快速的CyHV-3检测方法就显得十分必要。

目前，很多国家地区的研究人员已建立了多种CyHV-3的检测方法。虽然细胞培养分离技术是病毒病最准确的诊断手段，但该病毒的特性及技术操作本身的繁杂耗时使其成为快速诊断的局限。捕获抗原或抗体的ELISA技术在鱼的疾病感染状态检测中具有重要的作用，但灵敏度不够高的缺陷限制了其在检测上广泛应用，因此基于ELISA的CyHV-3抗原或抗体检测常作为一种诊断的辅助工具[23-24]。实际上，PCR及其延伸技术如巢式PCR、实时荧光定量PCR等技术在疾病流行病学调查中应用最广泛，常常成为检测的首选。其中，基于TK[12]、Sph1-5改进的PCR及Gilad 等建立的实时定量PCR具有更高的灵敏度而被OIE推荐为CyHV-3的分子检测方法[13-25]。

该研究应用焦磷酸测序技术建立了一种新的CyHV-3检测方法。焦磷酸测序技术是由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应。该测序系统能在1 h左右对大量样品进行测序，极大地提高了工作效率。在微生物学、表观遗传学、法医学等领域具有较广泛的应用。如国内研究人员应用焦磷酸测序技术对牛病毒性腹泻病毒[26]、施马伦贝格病毒[27]、猪甲型H1N1流感病毒[28]等病毒进行鉴定分型；Gu等运用多重焦磷酸测序技术对大肠杆菌E.coliO157 株的5个单核苷酸多态性位点进行检测分析，从而达到对大肠杆菌E.coliO157 株进行快速分型的目的[29]；Rajeevan等通过焦磷酸测序技术对感染两种不同细胞系的人类乳头瘤病毒16基因组的L1 基因3′ 端和长调控区的19个胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(Cytosine guanine dinucleotide，CpG)位点进行定量分析，发现在两种不同细胞系的人乳头瘤病毒存在超过40倍的甲基化修饰差异[30]，这种无须克隆的焦磷酸测序技术为多个甲基化特异性位点分析提供了便捷的工具。

该研究选择了CyHV-3 DNA聚合酶基因保守区域作为检测靶基因并设计检测引物和测序引物，利用焦磷酸测序平台直接读取序列，特异性强、方便快速，适用于出入境口岸大批量样品检测。

致谢：感谢中国检验检疫科学研究院王娜老师、张旻老师和景宏丽老师在实验过程中提供的帮助。

[1]HEDRICK R P, GILAD O, YUN S, et al. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of common carp[J]. J Aquat Anim Health, 2000, 12(1):44-57.

[2]PERELBERG A, SMIRNOV M, HUTORAN M, et al. Epidemiological description of a new viral disease afflicting cultured cyprinus carpio in Israel[J]. Isr J Aquacult-Bamid, 2003, 55(1):5-12.

[3]PIKARSKY E, RONEN A, ABRAMOWITZ J, et al. Pathogenesis of acute viral disease induced in fish by carp interstitial nephritis and gill necrosis virus[J]. J Virol, 2004, 78(17):9544-9551.

[4]GILAD O, YUN S, ADKISON M A, et al. Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi[J]. J Gen Virol, 2003, 84(Pt 10):2661-2667.

[5]COSTES B, RAJ V S, MICHEL B, et al. The major portal of entry of koi herpesvirus in cyprinus carpio is the skin[J]. J Virol, 2009, 83(7):2819-2830.

[6]BRETZINGER A, FISCHER-SCHERL T, OUMOUNA M, et al. Mass mortalities in koi carp, cyprinus carpio, associated with gill and skin disease[J]. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 1999, 19(5):182-185.

[7]BOUTIER M, RONSMANS M, RAKUS K, et al. Cyprinid herpesvirus 3: An archetype of fish alloherpesviruses[J]. Adv Virus Res, 2015, 93:161-256.

[8]李莹莹, 王 庆, 曾伟伟,等. 锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定[J]. 水产学报, 2014, 38(8):1159-1166.

[9]朱 霞, 李新伟, 王 好, 等. 一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2011, 33(5): 340-343.

[10]刘 荭, 史秀杰, 高隆英, 等. 进口锦鲤暴发病病原的 nested—PCR 鉴定[J]. 华中农业大学学报, 2002, 21(5): 414-418.

[11]DONG C F, WENG S P, LI W, et al. Characterization of a new cell line from caudal fin of koi, cyprinus carpio koi, and first isolation of cyprinid herpesvirus 3 in China[J]. Virus Res, 2011, 161(2):140-149.

[12]BERCOVIER H, FISHMAN Y, NAHARY R, et al. Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its use for a highly sensitive PCR based diagnosis[J]. BMC Microbiol, 2005, 5:13.

[13]GILAD O, YUN S, ZAGMUTT-VERGARA F J, et al. Concentrations of a koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected cyprinus carpio koi as assessed by real-time Taqman PCR[J]. Dis Aquat Org, 2004, 60(3):179-187.

[14]GUNIMALADEVI I, KONO T, VENUGOPAL M N, et al. Detection of koi herpesvirus in common carp,CyprinuscarpioL., by loop-mediated isothermal amplification[J]. J Fish Dis, 2004, 27(10):583-589.

[15]DISHON A, PERELBERG A, BISHARA-SHIEBAN J, et al. Detection of carp interstitial nephritis and gill necrosis virus in fish droppings[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(11):7285-7291.

[16]VRANCKEN R, BOUTIER M, RONSMANS M, et al. Laboratory validation of a lateral flow device for the detection of CyHV-3 antigens in gill swabs[J]. J Virol Methods, 2013, 193(2):679-682.

[17]SALEH M, EL-MATBOULI M. Rapid detection of Cyprinid herpesvirus-3 (CyHV-3) using a gold nanoparticle-based hybridization assay[J]. J Virol Methods, 2015, 217:50-54.

[18]LIEVENS B, FRANS I, HEUSDENS C, et al. Rapid detection and identification of viral and bacterial fish pathogens using a DNA array-based multiplex assay[J]. J Fish Dis, 2011, 34(11):861-875.

[19]NYRÉN P. Enzymatic method for continuous monitoring of DNA polymerase activity[J]. Anal Biochem, 1987, 167(2): 235-238.

[20]AHMADIAN A, EHN M, HOBER S. Pyrosequencing: history, biochemistry and future[J]. Clinica Chimica Acta, 2006, 363(1-2): 83-94.

[21]DONG C, LI X, WENG S, et al. Emergence of fatal European genotype CyHV-3/KHV in mainland China[J]. Vet Microbiol, 2013, 162(1):239-244.

[22]SUNARTO A, MCCOLL K A, CRANE M S J, et al. Isolation and characterization of koi herpesvirus (KHV) from indonesia: Identification of a new genetic lineage[J]. J Fish Dis, 2011, 34(2):87-101.

[23]RONEN A, PERELBERG A, ABRAMOWITZ J, et al. Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured cyprinus carpio[J]. Vaccine, 2003, 21(32):4677-4684.

[24]ADKISON M A, GILAD O, HEDRICK R P. An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the koi herpesvirus (KHV) in the serum of koi cyprinus carpio[J]. Fish Pathol, 2005, 40(2):53-62.

[25]YUASA K, SANO M, KURITA J, et al. Improvement of a PCR method with the sph 1-5 primer set for the detection of koi herpesvirus (KHV)[J]. Fish Pathol, 2005, 40:37-39.

[26]刘海生, 张永强, 赵永刚,等. BVDV 1型和2型焦磷酸测序检测方法的建立[J]. 中国兽医杂志, 2014, 50(7):14-17.

[27]王彩霞, 林祥梅, 张永宁,等. 施马伦贝格病焦磷酸测序检测方法的建立[J]. 中国动物检疫, 2014, 31(10):57-61.

[28]孙 涛, 张太翔, 徐 彪,等. 焦磷酸测序技术在确证猪甲型H1N1流感病毒中的应用[J]. 中国动物检疫, 2011, 28(4):48-52.

[29]GU Y, MAO X, ZHA L, et al. Development of a candidate method for forensic microbial genotyping using multiplex pyrosequencing combined with a universal biotinylated primer[J]. Forensic Sci Int, 2015, 246:e1-e6.

[30]RAJEEVAN M S, SWAN D C, DUNCAN K, et al. Quantitation of site-specific HPV 16 DNA methylation by pyrosequencing[J]. J Virol Methods, 2006, 138(1-2): 170-176.

Development of pyrosequencing assay for detection of Cyprinid herpesvirus 3

ZHENG Shu-cheng1,2, WANG Qing1, LI Ying-ying1, ZENG Wei-wei1, WANG Ying-ying1, LIU Chun1, SHI Cun-bin1

(1. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Fishery Drug Development of Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology of Guangdong Province, Guangzhou 510380; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To develop one method based on pyrosequencing for high throughput, automated and rapid detection of Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3), specific primer pairs for amplification and sequencing were designed that targeting conserved region ofORF55,ORF79 andORF92 gene of CyHV-3, and the optimal primers were screened by PCR amplification. The results of sensitivity and specifity test showed the primers againstORF79 gene are the best primers for PCR amplification with the detection limit as least as 100 copies and specific for the detection of CyHV-3. The sequencing result of pyrosequencing using PCR product indicated the obtained sequence shares 100% identity with CyHV-3-U, I, J and GZ11 isolates. Therefore, this assay could be used as a new tool for the diagnosis of CyHV-3 infections on a large scale samples in ports of exit and entry due to its convenient and rapid characteristic.

Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3); koi herpesvirus (KHV); pyrosequencing; detection

2016-08-08；

2016-09-05

国家科技支撑计划(2013BAD12B02)

郑树城，硕士研究生，主要从事水生病毒学研究，E-mail：shucheng1991@126.com

王 庆，博士，副研究员，主要从事水生病毒学研究，E-mail：sunny_929@163.com

Q78

B

2095-1736(2017)03-0095-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.095