高效液相色谱法测定发酵液中的D-核糖与葡萄糖

崔凤杰，胡婉君，周珏，孙文敬，魏转，徐勤华，刘长峰

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.河北化工医药职业技术学院，河北石家庄050026；3.山东德普化工科技有限公司，山东泰安271200）

高效液相色谱法测定发酵液中的D-核糖与葡萄糖

崔凤杰1，胡婉君1，周珏1，孙文敬1，魏转2，徐勤华3，刘长峰3

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.河北化工医药职业技术学院，河北石家庄050026；3.山东德普化工科技有限公司，山东泰安271200）

以RID为检测器，建立高效液相色谱法定量测定发酵液中葡萄糖和D-核糖的方法。该方法的测定条件为：柱型Shodex Suger SH1011，流动相为0.005 mol/L的稀硫酸溶液，柱温为50℃，进样量为10 μL。底物葡萄糖和产物D-核糖的出峰时间分别为11.573 min和13.313 min。得到底物葡萄糖和产物D-核糖的回归方程分别为Y=6.868 4X-0.069 1和Y=6.556 5X+0.004 6，其中Y为葡萄糖或D-核糖的质量浓度，X为对应的峰面积。线性范围在2 g/L～45 g/L时，该法精密度、稳定性和重现性均良好；葡萄糖的平均回收率为99.27%，D-核糖的平均回收率为99.61%，RSD值分别为0.38%和0.14%，说明本方法准确可行。

D-核糖；高效液相色谱法；糖类检测

D-核糖又称D-呋喃核糖，是一种功能性的五碳糖，广泛存在于核糖核酸、NAD、NADP及FAD等中，具有抗衰老、调节体内血糖、血脂含量等功能[1-3]。D-核糖也是诸多药物或食品添加剂合成的中间体和平台化合物[4-5]。在工业生产中，D-核糖的发酵底物一般为淀粉水解糖，其主要成分为葡萄糖。因此，在微生物发酵生产D-核糖过程中，主要涉及底物葡萄糖和产物D-核糖的检测和分析。目前，国际上公认的D-核糖的检测方法主要有苔黑酚法[6]和HPLC法。苔黑酚法[7]虽然有较高的实用性和经济性，但样品的处理过程比较复杂，检测时间也偏长，并且样品中的葡萄糖对检测结果的干扰性较大，可能会导致测定误差较大。近年来，相关的国外文献中有关D-核糖的检测方法均为HPLC法[8-10]。

本文研究了HPLC-RID法同时检测发酵液中D-核糖和葡萄糖，并对其进行方法学考察[11-14]，为建立快速、简便、准确的D-核糖和葡萄糖的定量分析方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent1100型高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；FA1004型电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司；SW-CJ-2F型双人双面垂直净化工作台：上海博迅实业有限公司；YXQ-WF32型卧式方形压力蒸汽灭菌锅：天水华圆医疗器械有限公司；HYL-C型组合式摇床：太仓市强乐试验设备有限公司；DHP-9272型电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；TGL-18M型台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）UJS0717：江苏大学生物工程研究所选育并保藏。

D-核糖发酵液：江苏大学生物工程研究所自制；D-核糖：纯度≥99%，Sigma-Aldrich；葡萄糖、硫酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇：色谱级，美国Tedia公司；纯净水：杭州娃哈哈集团。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备

斜面培养基（g/L）：山梨醇 5，蛋白胨 10，NaCl 2，酵母膏2，琼脂20，用1 mol/L的 HCl或1 mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0。该培养基用于菌种保藏及活化。

种子培养基（g/L）：葡萄糖 20，酵母膏 3，K2HPO43，KH2PO41，用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0。该培养基用于发酵种子液的制备。

发酵培养基（g/L）：玉米淀粉水解液120 g/L（以葡萄糖计），玉米浆 15，（NH4）2SO47.5，酵母粉 1.0，MnSO4·H2O 0.05，CaCO320。用5 mol/L的HCl或NaOH溶液调节pH至7.0。该培养基用于发酵生产D-核糖。

1.2.2 菌种活化及保藏

将配好的斜面培养基在121℃下灭菌20 min，待冷却后接入一环菌种，并置于36℃的恒温培养箱中培养24 h。可将培养好的斜面放置于4℃的冰箱中保藏。

1.2.3 种子培养

挑取试管中的一环菌种接至种子培养基中（每250 mL锥形瓶中装20 mL种子培养基），在36℃、240 r/min组合式摇床上培养20 h。

1.2.4 D-核糖发酵液制备

将培养好的种子液按照10%的接种量，接种至装有20 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中进行发酵，在36℃、240 r/min组合式摇床上培养。

1.2.5 D-核糖和葡萄糖标品溶液制备

准确称取适量的D-核糖标品（纯度≥99%）和葡萄糖标品（纯度99%），用0.005 mol/L的稀硫酸溶液配制成不同浓度的D-核糖和葡萄糖混合标准品溶液，稀释成的浓度分别为 2、4、5、6、8、10、15、30、45 g/L。

1.2.6 HPLC条件

色谱柱：ShodexSugerSH1011（8.0mmI.D×300mm）；流动相：0.005 mol/L的稀硫酸溶液；流速：0.6 mL/min；检测器：示差检测器；柱温：50℃；进样量：10 μL。

1.2.7 D-核糖发酵液样品预处理

利用台式高速离心机，将D-核糖的发酵液在4 200 r/min下离心15 min，来除去菌体和其他杂质，并将上清液稀释适当倍数后用0.45 μm的水系微孔滤膜过滤后备用。

1.2.8 数据处理

2 结果与讨论

2.1 D-核糖和葡萄糖的标准曲线及回归方程

先分别将葡萄糖和D-核糖的标品溶液进行HPLC分析，再在相同的条件下对底物葡萄糖和产物D-核糖的混合标准品进行分析，结果如图1和图2所示。从图中可以看出，葡萄糖的保留时间为11.573 min，D-核糖的保留时间为13.313 min。

相同色谱条件下，用HPLC依次测定浓度为2、4、5、6、8、10、15、30、45 g/L 的 D-核糖和葡萄糖的混合标准品溶液，并记录不同的峰面积。再对混合液的色谱图峰面积测定结果进行线性回归，得到的葡萄糖线性回归方程为：Y=6.868 4X-0.069 1；D-核糖的线性回归方程为：Y=6.556 5X+0.004 6，式中Y为葡萄糖或D-核糖的质量浓度（g/L），X为对应的峰面积。葡萄糖的线性回归方程的决定系数R2=0.999 9，D-核糖的线性回归方程的决定系数R2=0.999 8，t检验和F检验的结果都表示为显著，说明葡萄糖和D-核糖在质量浓度为2 g/L～45 g/L的范围内都成良好的线性关系，葡萄糖和D-核糖的标准曲线如图3和4所示。

2.2 精密度试验

随机抽取一组样品溶液来进行精密度的测定。用HPLC对该样品进行连续重复测定5次，并记录峰面积值，并计算相对标准偏差RSD，具体结果如表1所示，葡萄糖和D-核糖的RSD值分别为0.68%和0.84%，表明本方法精密度良好。

图1 葡萄糖和D-核糖标准品的HPLC图Fig.1 HPLC spectrum of glucose and D-ribose standands

图2 葡萄糖和D-核糖混合标准品的HPLC图Fig.2 HPLC spectrum of mixed glucose and D-ribose standards

图3 高效液相色谱测定葡萄糖的标准曲线Fig.3 Standard curve of glucose determined by HPLC

图4 高效液相色谱测定D-核糖的标准曲线Fig.4 Standard curve of D-ribose determined by HPLC

表1 精密度结果Table 1 Precision of experiment results

2.3 稳定性试验

稳定性结果见表2。将样品溶液在室温下放置0、1、2、3、4 h后，在相同的色谱条件下用HPLC测定其峰面积值。再根据相应的线性回归方程来计算样品溶液中的葡萄糖和D-核糖的质量浓度，其RSD值分别为1.89%和1.94%，由表2分析可知样品溶液在4 h内的稳定性良好。

表2 稳定性结果Table 2 Stability of experiment results

2.4 重现性试验

取5份相同的D-核糖发酵液，在相同的色谱条件下，用HPLC测定并记录峰面积值。依据线性回归方程计算发酵液中葡萄糖和D-核糖的质量浓度，其RSD值分别为1.23%和1.17%，结果发现本法重现性较好（表 3）。

表3 重现性结果Table 3 Reproducibility of experiment results

2.5 加标回收率

加标回收率是检验待测样品在前处理和仪器检测中的损失情况，以此来评估检测方案的可行性。准确吸取5份体积为25 mL，葡萄糖和D-核糖的质量浓度分别为26.35 g/L和20.21 g/L的D-核糖发酵液于50 mL的容量瓶中，分别向这5份溶液中加入5 mL的葡萄糖和D-核糖的质量浓度都为2.0 g/L的标准品混合溶液。用0.005 mol/L的稀硫酸溶液定容至50 mL后，用HPLC测定并记录各峰面积值，再依据线性回归方程来计算溶液中葡萄糖和D-核糖的质量浓度。结果如表4所示，葡萄糖的平均回收率为99.27%，D-核糖的平均回收率为99.61%，RSD值分别为0.38%和0.14%，说明本方法准确可行。

表4 加标回收率结果Table 4 Recovery rates of experiment results

3 结论

本文以RID为检测器，建立了HPLC-RID同时定量检测了发酵液中D-核糖和葡萄糖的方法，方法简便、准确、灵敏度高，稳定性和重现性好。所采用的色谱条件可将底物葡萄糖和产物D-核糖有效分离，显著减少了葡萄糖对D-核糖检测结果的干扰。该方法的建立为同时定量分析发酵液中D-核糖和葡萄糖和准确评价生产菌株的葡萄糖利用效率和D-核糖合成得率提供了技术支持。

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Determination of D-Ribose and Glucose by High Performance Liquid Chromatography Detection

CUI Feng-jie1，HU Wan-jun1，ZHOU Jue1，SUN Wen-jing1，WEI Zhuan2，XU Qin-hua3，LIU Chang-feng3
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China；2.Hebei Chemical and Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，Hebei，China；3.Shandong Depu Chemical Technology Co.，Ltd.，Tai'an 271200，Shandong，China）

A rapid HPLC method for simultaneously and quantitatively determining the D-ribose and glucose with RID-detector was established as：Shodex Suger SH1011 column，0.005 mol/L of diluted sulfuric acid solution as the mobile phase，column temperature of 50 ℃ and the injection volume was 10 μL.Retention time of glucose and D-ribose was 11.573 min and 13.313 min，respectively.The regression equations of glucose and D-ribose were Y=6.868 4X-0.069 1 and Y=6.556 5X+0.004 6，respectively，in which Y means concentration of glucose/D-ribose and X means the peak area ratio.Within the linear range of 2 g/L-45 g/L，the precision，stability and reproducibility of the established method was good.The average coefficient of recovery of glucose and D-ribose were 99.27%and 99.61%，RSD were 0.38%and 0.14%respectively，which revealed that the method was accurate and credible.

D-ribose；high performance liquid chromatography（HPLC）；determination of saccharide

2016-10-09

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.031

山东省泰安市科技发展计划项目（201340629）；江苏大学“青年骨干教师培养工程”青年学术带头人培育计划项目；江苏大学高级专业人才科研启动基金项目（08JDG029）

崔凤杰（1980—），男（汉），教授，博士研究生，研究方向：食品生物技术。