宋先东+李扬+刘波+闫昭威+孙继平+朱敏
[摘要] 目的 探讨NLRP3炎性体信号通路在急性痛风性关节炎患者中的变化。 方法 选取来我院就诊的360例患者作为研究对象。设置3个实验,分别为蛋白质免疫印迹实验、酶联免疫吸附测定实验和关节滑膜免疫组化实验。每个实验设6组对照实验(正常组,模型组,秋水仙碱阳性药组及GT低、中、高剂量组),每组20例患者。取样观察患者关节滑膜组织,检测白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎性体的表达,分析测定平均积分吸光度(IA)。 结果 治疗前后对比发现GT中、高剂量组的NLRP3的表达水平降低(P<0.05),GT各组IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表达均明显降低(P<0.05)。 结论 使用GT和秋水仙碱治疗急性痛风性关节炎时可能会降低NLRP3炎性体信号通路中炎性因子的表达,对患者体内的NF-κB的活化和IL-1β 分化成熟也会有一定的影响。
[关键词] NLRP3;急性痛风性关节炎;桂枝芍药知母汤煎剂;抗炎免疫
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2017)17-0015-03
[Abstract] Objective To investigate the changes of NLRP3 inflammatory signaling pathway in patients with acute gouty arthritis. Methods A total of 360 patients admitted in our hospital were selected as the research objects. Three experiments were performed, including protein immunoblotting experiment, enzyme-linked immunosorbent assay and synovial immunohistochemistry experiment. In each experiment, six groups of control experiments(normal group, model group, colchicine positive drug group and GT low, medium and high dose group) were set,with 20 patients in each group. Samples in synovial tissues were observed. The expressions of interleukin-6(IL-6), tumor necrosis factor-α(TNF-α) and Nod-like receptor protein 3(NLRP3) were detected. The average integral absorbance (IA) was measured. Results It was found that the expression levels of NLRP3 in the GT middle and high dose groups were decreased after treatment, compared with those before treatment(P<0.05). The expressions of 1β, IL-6, TNF-α and NF-κB were significantly decreased in the GT groups(P<0.05). Conclusion The use of GT and colchicine in the treatment of acute gouty arthritis may reduce the expressions of inflammatory cytokines in the NLRP3 signaling pathway, and will have a certain impact on the activation of NF-κB and differentiation and maturation of IL-1β in patients.
[Key words] NLRP3; Acute gouty arthritis; Guizhi Shaoyao Zhimu decoction; Anti-inflammatory immunity
痛風是由单尿酸盐(monosodiumurate,MSU)大量沉积导致的一种晶体相关性关节病[1-3]。而NLRP3是 NLRP 蛋白家族中的一个典型代表,主要作用为参与识别PAMP、感知内源性DAMPs、在固有免疫系统识别病原体中发挥着重要的作用。研究NLRP3炎性体信号通路在急性痛风性关节炎患者治疗过程中的变化对治疗痛风性关节炎可能带来新的突破,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择在我院就诊的急性痛风性关节炎患者360例。主要药物及试剂:桂枝芍药知母汤煎剂,其药物组成为生姜、白术各15 g,知母、防风、附子、桂枝各12 g,白芍9 g、甘草、麻黄各6 g。利用传统方法和现代科学技术相结合的方法制成质量浓度为(1.25~1.30)g/mL(80℃)的中药制剂浸膏80 mL,制剂所含生药量大约为2 g/mL,使用时需适量稀释。秋水仙碱,质量浓度为20 g/mL的尿酸钠注射悬液。
1.2 方法
1.2.1 分组及给药 把360例患者随机分配到3个实验中,每一个实验120例患者,实验分别为蛋白质免疫印迹(western blot)实验、酶联免疫吸附测定(ELISA)实验和关节滑膜免疫组化实验。每一个实验分为6组对照实验,分别为正常组、模型组、秋水仙碱阳性药组、桂枝芍药知母汤煎剂(GT)高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组20例。按照规定给药,正常组和模型组连续7 d,每天让患者在同样的条件下休养。桂枝芍药知母汤煎剂(GT)低剂量组用量为4 g/kg,中剂量组用量为8 g/kg,高剂量组用量为12 g/kg,秋水仙碱使用剂量为3×10-3 g/kg。
1.2.2 患者关节滑膜组织中ASC表达 采集患者少量的关节滑膜组织,分组封装后移入低温冰箱中保存,冰箱温度设置为-70℃,用于测定各组样本的IAO含量。使用Quantity One 4. 62版凝胶IA分析软件分析Western blot检测中制作好的显色条带,测定各组样本的IAO含量。
1.2.3 患者关节滑膜组织中NLRP3平均积分吸光度IA的表达 对患者左侧关节(关节近端及远端各保留约0. 5 cm)进行采样。然后依照脱钙、脱水、切片、染色、封片等步骤进行制片。观察切片,使用图像分析软件对每个切片选取的6个高倍视野(10×40)进行分析,测定IA含量并计算平均IA值[6,7]。
1.2.4 关节滑膜组织TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6的表达 对采集到的左侧关节样本中加入适量液氮,使用研钵将样本研磨成粉末状,加入少量生理盐水研匀,使用离心机以3 000 r/min的速度离心10 min,取上清液测定TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6的含量并绘制标准曲线,测定[8,9]。
1.3统计学方法
所有数据采用SPSS19.0系统进行处理,计量资料以(x±s)形式表示,组间对比使用LDS单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义[10]。
2 结果
2.1 患者体内炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB含量比较
未进行治疗前患者均出现关节红肿、活动减少的症状。患者体内炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB等检测结果明显高于正常组(P<0.05)。治疗后,GT低、中、高剂量组的IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表达均下降(P<0.05)。见表1。
2.2 各组NLRP3平均值比较
模型组患者关节滑膜组织中NLRP3平均IA表达水平比正常组明显升高(P<0.05);模型组患者关节滑膜组织中NLRP3平均IA表达水平比秋水仙碱组和GT高剂量组、中剂量组患者升高(P<0.05);GT低剂量组患者关节滑膜组织中NLRP3平均IA表达水平降低,但差异无统计学意义。见表2。
3讨论
近年来,人们生活方式不断改变,环境破坏日益严重,急性痛风性关节炎的发病率出现明显上升的趋势,急性痛风性关节炎对患者的生活质量产生巨大的不利影响[11]。痛风的主要特点为反复发作,发作期间中一般会造成关节损伤,引起关节疼痛。减轻患者痛苦和不便、防止关节受损、减少治疗痛风的高昂费用、增加生活舒适度等具有非常重要的意义。急性痛风性关节炎的患者多为青壮年男性,其一般特点是剧烈疼痛和具有自限性。NLRP3是NLRP蛋白家族中的一个典型代表,也被称为NALP3,会在骨髓源性的免疫细胞中如单核细胞、巨噬细胞等中大量表达,一般是由ASC激活后开始发挥作用,也就是说使NLRP3炎性体发挥作用的关键点是ACS。
ACS的主要作用有参与识别PAMP,感知内源性DAMPs,在固有免疫系统识别病原体中发挥着重要的作用,但是NLRP3也具有双重性,在病毒入侵初期NLRP3的表现会大量增加,这是一种自我免疫保护反应。另一方面,当炎性体感知到外界病毒病菌等的刺激后可能会主动诱发炎症反应,导致感染和其他病情加重。虽然NLRP3的这一现象在痛风类相关疾病研究领域中尚无定论,但是不可以排除NLRP3在痛风类相关疾病中存在免疫保护的可能。
目前,NLRP3炎性体在急性痛风性关节炎和各类感染性疾病中都起到关键的作用,研究NLRP3炎性体通路的阻滞可能会为各种慢性炎症以及急性痛风性关节炎防治提供新的重要治療方法以及启迪新的诊疗思路与手段。当患者患上急性痛风性关节炎时,患者NLRP3炎性体会在外周血中发生异常表达,NLRP3对观察痛风炎症反应出现起到不可忽视的作用,也证明了NLRP3炎性体在急性痛风性关节炎中发挥重要作用。急性痛风性关节炎与我们的生活习惯密不可分,平时我们要注意饮食与生活习惯,节制饮酒、适量饮食、少吃高嘌呤的食物,例如豆制品类、高蛋白饮食,注意锻炼,养成良好的生活习惯对预防急性痛风性关节炎有一定作用。患者注意以上几点再加上积极配合治疗,痊愈时间也会缩短。对于NLRP3,充分了解NLRP3炎性体信号通路在急性痛风性关节炎患者中变化情况以及免疫保护及致炎双重性并且考虑其对机体的整体影响的条件下做出干预,改良NLRP3,加强NLRP3的免疫保护作用并且减轻副作用可以让NLRP3的应用更安全,范围更广泛,更加值得我们重视和推广;对于急性痛风性关节炎而言又有了新的更安全有效的治疗和防御手段,可以减少患者痛苦,提高幸福指数。
综上,使用GT和秋水仙碱治疗急性痛风性关节炎时可能会降低NLRP3炎性体信号通路中炎性因子的表达,对患者体内的NF-κB的活化和IL-1β 分化成熟也会有一定的影响。
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(收稿日期:2017-04-25)