滋阴补阳方序贯疗法对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞(GC)分泌功能和细胞因子基因表达的影响

徐括琴，尹巧芝，党丽英，侯玉华，杨小风

1.郑州大学附属郑州中心医院 妇产科(郑州 450000),2.成都中医药大学妇科教研室(成都 610075)

滋阴补阳方序贯疗法对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞(GC)分泌功能和细胞因子基因表达的影响

徐括琴1，尹巧芝2，党丽英1，侯玉华1，杨小风1

1.郑州大学附属郑州中心医院 妇产科(郑州 450000),2.成都中医药大学妇科教研室(成都 610075)

目的：研究滋阴补阳方序贯疗法对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞(GC)分泌功能和细胞因子基因表达产生的影响。方法：利用随机数字表法将实验雌性性SD大鼠分为3组，包括空白对照组、滋阴组以及补阳组；选取6周龄同样大鼠灌胃，调配空白血清与用药血清；对PCOS大鼠GC及黄素化颗粒细胞进行分离培养，并以随机方法分为10组，比较各组细胞培养液里面雌二醇(E2)、类胰岛素增长因子(IGF-1)、干细胞因子(SCF)以及睾酮(T)水平，并观察SCF mRNA表达情况。结果：模型组1GC里面E2水平明显低于对照组(P<0.05)，且SCF水平明显高于对照组；滋阴方组2 SCF与滋阴方组3 SCF水平均明显低于模型组1(P<0.05)，而滋阴方组2 E2与滋阴方组3 E2水平均明显高于模型组1(P<0.05)；模型组1大鼠GC SCF mRNA表达明显高于对照组，且IGF-1灰度值明显小于对照组(P<0.05)，滋阴方组2 与滋阴方组3 GC SCF mRNA表达均显著低于模型组1(P<0.05)，滋阴方组3 IGF-1灰度值明显高于模型组1(P<0.05)；模型组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞里面T水平明显高于对照组(P<0.05)；补阳方组2与补阳方组3 T水平明显低于模型组(P<0.05)，而补阳方组1 T水平与模型组的比较无显著差异(P>0.05)；对照组、模型组、补阳方组黄素化颗粒细胞里面SCF水平、SCF mRNA表达以及IGF-1灰度值比较无显著差异(P>0.05)。结论：对PCOS采取滋阴补阳方序贯疗法，能提高GC分泌功能，同时可以降低卵泡期SCF基因在体内的表达实现，可为PCOS排卵障碍临床治疗提供依据。

多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)是与各器官、系统正常内分泌紊乱相关的疾病，患者临床表现具有多样化特点，现今其病理机制缺乏统一结论。有报道指出，育龄妇女群体PCOS发病率高达5%～10%，并且和75%左右无排卵性不孕患者密切相关[1]。亦有研究显示，部分卵巢局部调节因子的表达和PCOS发病存在紧密联系[2]。 干细胞因子(Stem cell factor，SCF)属于卵巢局部相对重要的一种生长因子，可对细胞增殖分化产生促进作用。现阶段，与SCF在PCOS患者卵巢局部产生的促进作用相关研究较多，可是涉及SCF在PCOS临床发病机制中作用的研究却不多。本文以大鼠实验，探讨滋阴补阳方序贯疗法对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞(GC)分泌功能和SCF基因表达产生的影响，现汇报如下。

材料与方法

1 动物 选取84只雌性SD大鼠，每只日龄均为21日，体重为40～50 g；另选取50只雌性SD大鼠，每只6周龄，并且体重为170～180 g，所有大鼠均清洁级饲养，给予自然光照，控制室温不超过20 ℃～25 ℃范围。

2 药物与主要试剂 由武汉远城科技发展公司提供脱氢表雄酮(DHEA)；浙江田雨药用油有限公司提供实验注射大豆油；滋阴方组成成分为：紫河车、熟地黄、菟丝子、当归、白芍以及山茱萸等中药；补阳方组成成分为：淫羊藿、党参、补骨脂、巴戟天以及川续断等。混合以上中药，置于水中浸泡1 h后，采用武火煮沸，然后用文火煮20 min，将其过滤，并且重复煎2次，最后合并滤液，置于55 ℃～60 ℃水浴条件下浓缩。实验给药量依据人鼠剂量[3]进行换算，其中滋阴方含生药量为2.48 g/kg，对于补阳方，则含生药量为2.20 g/kg，并将煎剂冷却后放在4℃温度下保存。

由HyClone公司提供DMEM/F12培养基、胰蛋白酶，由BioSource 公司提供10%胎牛血清；北京赛百盛生物工程公司提供SCF与β-actin引物，上海恒远生物科技有限公司提供ELISA试剂盒；Bio-Teke公司提供RNA提取试剂盒，；SYBRPremix Ex Taq，TakaRa公司；上海博升生物科技有限公司提供孕马血清促性腺激素(PMSG)，并由上海生物化学制药厂提供人绒毛膜促性腺激素(HCG)。

3 实验方法

3.1 构建实验PCOS大鼠模型:对84只雌性SD大鼠进行编号，将其随机分成模型组(n=67)与空白对照组(n=17)。84只大鼠全部在21 d龄断乳，实验开始第1 天为适应性喂养进行2 d后，即在23 d龄，模型组每天需定时在其颈背部采取皮下注射方式予以6 mg/100 g的DHEA以及0.2 ml量的注射用大豆油，并对对照组每天在颈背部采取皮下注射方式予以0.2 ml量的注射用大豆油，均持续应用1月。模型组大鼠在注射第20 d需要每天获取其阴道涂片，通过阴道涂片了解到大鼠正在动情间期，没有动情周期变化以及排卵现象；2组均在第30 d进行眼眶静脉采血，其中模型组大鼠血清激素睾酮水平升高表示造模成功，本实验有7只造模失败必须剔除。

3.2 分裂并且培养颗粒细胞：在第31天需对每只大鼠采取颈部皮下注射方式予以PMSG 50IU，并于48h后在模型组里面以随机原则选30只大鼠，同时在空白对照组里面选10只大鼠，将其处死之后摘取卵巢，有效分离并且培养GC。对于模型组与对照组之中剩余大鼠，分别为30只与7只，均以颈部皮下注射方式给予HCG 25IU，并在注射后第6天将其处死，然后摘取卵巢有效分离并且培养卵巢部位黄素化颗粒细胞。处于无菌条件下对所取卵巢进行分离处理，去除附近脂肪组织，放于低倍显微镜下采取25号针头将大鼠卵泡刺破，并且轻拍挤压，确保卵母细胞与其颗粒细胞同时顺利逸出。采用200目钢筛进行过滤，并在离心处理后收集颗粒细胞。选用0.4%台盼蓝进行染色计数，如果镜下没有染为蓝色，说明是死细胞[4]。控制GC密度数值为1.0×105/ml，并且接种于底面积25 cm2培养瓶里面，其中每培养瓶体积为1 ml，放在37℃且含5%CO2相应培养箱内部恒温培养。待大部分细胞基本贴壁之后需首次更换培养液，之后应该每隔48 h进行1次更换。待细胞培养48 h，需以0.1%胰酶消化，获得单细胞悬液，采取磷酸缓冲液冲洗2次，并以4%多聚甲醛将其固定10 min。如果HE染色显示细胞形态完整，外观为多角形，同时核呈深蓝色，此外胞浆淡红色伴随许多颗粒，且是GC，待其贴壁后备用[5]。

3.3 调配含药血清：将所选50只6周实验大鼠按照随机原则分为补阳组、滋阴组以及空白对照组，采用中药与0.9%NaCl溶液灌胃。对于灌胃给药剂量，必须是正常大鼠剂量十倍，保证2次/d，间隔时间为12 h，控制灌胃药总体积≤3 ml，且持续给药3 d，注意第3 d取血样前严格禁食12 h，同时1次给予全天剂量，并于给药1 h后进行麻醉处理，再行心脏采血。离心处理血样之后，同组血清混合，然后过滤，置于56 ℃温度下灭活，放在-20 ℃条件存储[6]。

3.4 分组与药物干预： 对所培养获得的颗粒细胞进行分组，共10组，且各组样本包括5个复孔。具体干预措施为：空白对照组采用原代培养所获得的正常大鼠GC；模型组1采用模型组大鼠GC；滋阴方组1采用含5%滋阴方药相应血清完全培养液，其中包含DMEM/F12、1%三抗以及10%FCS；滋阴方组2采用含10%滋阴方药相应血清完全培养液进行研究；滋阴方组3采用含20%滋阴方药相应血清完全培养液进行研究；补阳方组1采用含5%补阳方药相应血清完全培养液进行研究；补阳方组2采用含10%补阳方药相应血清培养液进行研究；补阳方组3采用含20%补阳方药相应血清培养液进行研究；空白对照组采用原代培养所得正常大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞进行研究；模型组采用模型组大鼠所得卵巢部位黄素化颗粒细胞进行研究。

3.5 检测方法：以酶联免疫吸附法对各组培养上清液内SCF、E2以及T水平，严格依据试剂盒要求操作，各项测量数据必须独立实验重复超过3次，取均值；以逆转录PCR法(RT-PCR)[7]对大鼠SCF mRNA表达进行检测，首选通过荧光定量方法检测PCR，将RNA提取试剂盒所获得的总RNA进行反转录，变为cDNA，选择β-actin作该过程内参照平行管，并采用Real-time PCR完成SCF mRNA表达情况的检测，待两步法

PCR具体反应程序完成后，利用StepOnePlus Software软件自动获取QR值。以荧光定量RT-PCR法[8]测定IGF-1表达灰度值。

4 观察指标 观察各组细胞培养液里面E2、SCF、T水平、IGF-1表达灰度值及SCF mRNA表达情况。

结 果

1 对照组、模型组1与滋阴方组GC里面E2、SCF水平比较 模型组1GC里面E2水平为(24.53±6.02)pmol/L，明显低于对照组(33.54±6.09)pmol/L(P<0.05)，且SCF水平(2786.00±94.00)pg/ml，明显高于对照组(2549.00±58.00)pg/mL；滋阴方组2 SCF(2489.00±127.00)pg/ml与滋阴方组3 SCF(2473.00±109.00)pg/mL均明显低于模型组1(P<0.05)，而滋阴方组2 E2(33.28±3.57)pmol/L与滋阴方组3 E2(33.85±2.30)pmol/L均明显高于模型组1(P<0.05)。

2 对照组、模型组1与滋阴方组大鼠GC SCF mRNA表达情况、IGF-1灰度值比较 模型组1大鼠GC SCF mRNA表达(1.02±0.03)明显高于对照组(0.13±0.19)(P<0.05)，且IGF-1灰度值(154.93±8.17)明显小于对照组(169.20±2.68)；滋阴方组2 GC SCF mRNA表达(0.23±0.07)与滋阴方组3 GC SCF mRNA表达(0.20±0.14)均显著低于模型组1(P<0.05)，滋阴方组3 IGF-1灰度值(167.03±4.26)明显高于模型组1(P<0.05)。

3 对照组、模型组与补阳方组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞里面T、SCF水平比较 模型组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞里面T为(4.89±0.45)ng/ml，明显高于对照组(4.11±0.47)ng/ml(P<0.05)；补阳方组2 T(4.35±0.26)ng/ml与补阳方组3 T(4.32±0.29)ng/ml明显低于模型组(P<0.05)，而补阳方组1 T水平与模型组的比较无显著差异(P>0.05)；5组SCF水平比较无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 对照组、模型组与补阳方组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞里面T、SCF水平比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05

4 对照组、模型组与补阳方组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞SCF mRNA表达、IGF-1灰度值比较 模型组大鼠黄素化颗粒细胞SCF mRNA表达与IGF-1灰度值均小于对照组，可比较无显著差异(P>0.05)；补阳方组1、补阳方组2与补阳方组3大鼠黄素化颗粒细胞SCF mRNA表达及IGF-1灰度值稍高于模型组，但比较无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 对照组、模型组与补阳方组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞SCF mRNA表达、IGF-1灰度值比较

讨 论

排卵障碍性不孕常见原因为PCOS，患者临床表现特点、生化改变与具体发病机制存在高度异质性[9]。PCOS所致生殖功能障碍现象核心为排卵异常，如果卵泡发育障碍，就无法形成优势卵泡，降低卵泡颗粒细胞水平，引发卵泡膜细胞增生现象，卵泡无法充分成熟，使得卵巢出现多囊性改变。对于卵巢局部因子，其主要经细胞内调节、自分泌以及旁分泌等方式于PCOS发病机制中占有重要地位[10]。促进鼠类卵泡发育主要启动因子之一为SCF，卵巢组织中源于颗粒细胞SCF以及卵母细胞表面相应SCF受体结合，利用磷酸肌醇3该类激酶通路于控制哺乳动物体内卵母细胞生长以及卵泡激活或者发育方面产生着关键作用。相关实验研究显示，SCF能够诱导原始卵泡发育，一旦SCF异常，可引起原始卵泡启动障碍，导致不孕[11-12]。

PCOS多属祖国医学“不孕”、“闭经”或者“月经后期”范畴。由于病理环节关键在排卵异常，故谈勇教授依据“经水出诸肾”以及“肾主生殖”中医理论，同时以夏桂成教授所提出的治疗月经周期异常理论为基础，结合以往长期临床以及实验研究，发现滋阴补阳序贯法(即首先采取补精血滋阴方，然后配合补肾阳补阳方，进行序贯治疗)既能改善PCOS患者临床症状，又可优化卵巢局部各类因素。本实验前期结果显示，采取滋阴补阳序贯法可以减少PCOS大鼠血清所含T、E2水平，并提高IGF-1的表达，有效逆转内分泌异常状态，并且初步表明，实施滋阴补阳序贯法可影响PCOS模型卵巢部位卵泡发育情况与分泌功能，发挥改善下丘脑、垂体以及卵巢轴作用。

本研究表明，当PCOS模型大鼠处于卵泡发育期时，其GC所分泌产生的E2量显著少于正常大鼠GC，且其分泌产生的SCF量明显高于正常大鼠GC，合并颗粒细胞组织SCF mRNA表达上调现象。提示SCF已经参与PCOS产生过程。其机制极有可能是当患者处于卵泡期的时候，颗粒细胞SCF实际表达提升可能和其卵巢过多出现早期卵泡生长存在联系，因为卵泡发育早期，机体SCF可对腔前卵泡凋亡产生抑制作用，使得早期卵泡过多，引起卵巢多囊样变化，从而和PCOS患者囊状卵泡组织卵母细胞发育异常、持续没有排卵现象紧密相关。对于黄体期大鼠，黄素化颗粒细胞产生T水平显著高于正常对照组大鼠，然而该时期SCF水平与SCF mRNA表达情况并无明显差异。对于滋阴方含药血清，能够缓解类PCOS大鼠体内颗粒细胞所处功能性抑制状态，降低SCF mRNA表达。10%与20%滋阴方组的这种效果最为明显，提示中药作用存在量效关系。本实验补阳方含药血清能够抑制黄素化颗粒细胞产生T，其中10%浓度效果最明显。此外，模型组1大鼠IGF-1灰度值明显小于对照组，而滋阴方组3 IGF-1灰度值显著高于模型组1，与王钰等[13]研究结论一致。说明滋阴方可刺激 IGF-1分泌，上调其表达。

综上所述，滋阴补阳方序贯疗法可增强PCOS大鼠GC分泌功能，并且可能以下调卵泡期大鼠SCF基因具体表达、提高E2与IGF-1、降低T水平实现，从而对PCOS治疗发挥指导作用。

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(收稿：2017-02-19)

多囊卵巢综合征/中医药疗法 @滋阴补阳方 大鼠 动物，实验

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.07.083