肠三叶因子通过自噬在急性移植物抗宿主病中发挥保护作用

陈慧瑶，张伟，方芳，何颖，庄强，江松福

（温州医科大学附属第一医院 血液内科，浙江 温州 325015）

·论 著·

肠三叶因子通过自噬在急性移植物抗宿主病中发挥保护作用

陈慧瑶，张伟，方芳，何颖，庄强，江松福

（温州医科大学附属第一医院 血液内科，浙江 温州 325015）

目的：观察肠三叶因子（ITF）在急性移植物抗宿主疾病（aGVHD）中的保护作用及其机制。方法：建立C57BL/6（H-2b）小鼠至BALB/C（H-2d）小鼠的异基因骨髓移植（allo-BMT）模型，诱导aGVHD，根据处理方式不同，分成4组。空白对照组未接受任何处理；BM组仅接受骨髓细胞移植；aGVHD组同时接受骨髓细胞和脾脏细胞移植；ITF组预防性使用ITF治疗，其余处理同aGVHD组。观察比较各组小鼠aGVHD临床评分、生存时间、移植后外周血白细胞情况与自噬蛋白LC3在小肠黏膜上皮细胞内的表达。结果：成功建立并诱导aGVHD模型。与ITF组相比，aGVHD组小鼠提早出现典型的aGVHD临床症状，生存期显著缩短，移植后外周血白细胞最低值更低，上升缓慢，aGVHD临床评分增加（均P＜0.05）。小肠组织免疫组织化学染色结果显示，相较于BM组和ITF组，aGVHD组LC3表达水平明显增加（P＜0.05）。结论：ITF对aGVHD有保护作用，可能与ITF通过降低自噬水平改善aGVHD症状有关。

急性移植物抗宿主病；肠三叶因子；自噬；异基因骨髓移植；小鼠

急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD）发病机制尚未完全明确。目前认为它是多层面多步骤的病理反应，首先放化疗等预处理引起“细胞因子风暴”导致前炎症因子释放，炎症环境促进受体抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）活化供者的T细胞，最终导致供体T细胞进入并攻击aGVHD患者靶器官[1]。移植前的预处理导致胃肠道上皮屏障的破坏和炎症因子的大量释放[2]，所以肠道aGVHD不仅发生率高，而且在GVHD系统性损伤的级联放大过程中起着重要作用。本课题组前期研究发现肠三叶因子（intestinaltrefoil factor，ITF）可以通过修复肠道黏膜，在一定程度上预防aGVHD的发生[3]，但ITF对aGVHD的保护机制仍不明确。研究[4-5]证明自噬在维护肠道黏膜的稳定性和调节aGVHD上发挥重要作用。本研究进一步观察ITF对aGVHD中的保护作用，并探讨ITF预防aGVHD作用与自噬的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：供鼠：C57BL/6（H-2b）小鼠，黑色，雄性，6～8周龄。受鼠：BALB/C（H-2d）小鼠，白色，雌性，6～8周龄。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。小鼠均饲养于温州医学大学实验动物中心层流架内，每笼4～6只，温度25 ℃，湿度70%，昼夜照明时间12 h/12 h，垫料、饲料、饮用水均经高压灭菌处理。受鼠在移植前5 d开始饮用含庆大霉素（320 mg/L）的消毒饮用水，进行肠道净化，直至移植后2周。

1.1.2 主要试剂：台盼蓝购自上海西唐生物科技有限公司，红细胞裂解液购自上海碧云天公司，PBS购自美国Gibco公司，苏木精和伊红购自福建迈新生物技术有限公司，Anti-Mouse MHC I（H-2kb）IFTC和Anti-Mouse MHC I（H-2kd）PE购自奥地利eBiosci-ence公司，基因重组人小肠三叶因子（rh-ITF）购自北京大学蛋白质工程重点实验室，anti-LC3购自美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：将周龄相同的小鼠随机分成空白对照组、BM组、aGVHD组和ITF组，空白对照组3只小鼠，其余各组22只小鼠。空白对照组未接受任何处理；BM组仅接受骨髓细胞移植，无脾脏细胞移植；aGVHD组同时接受骨髓细胞和脾脏细胞的移植；ITF组从移植前1 d开始预防性使用ITF 0.1 mL/d（0.1 mg/mL，溶解在0.9%氯化钠溶液中）灌胃治疗，其余处理同aGVHD组。除空白对照组外，每组小鼠取12只，分别在第1、第2、第3、第4周的末期处死3只小鼠，取小鼠肠道做免疫组织化学染色。另取每组（空白对照组除外）10只小鼠，观察生存状况，外周血白细胞变化，脱毛、活动度、体质量等临床评分。

1.2.2 受鼠预处理：移植当天将小鼠装入经高压灭菌四周有小孔的2×5格子自制的木盒子里，尽量保证无菌环境。移植当天（即第0天）小鼠接受直线加速器全身照射（total body irradiation，TBI），照射剂量8 Gy，照射距离50 cm，照射时间8 min，剂量率1 Gy/min。

1.2.3 供鼠骨髓细胞和脾细胞制备：取出供鼠的股骨、胫骨和脾脏制成单细胞悬液。经红细胞裂解后，用PBS洗涤2次，最后重悬成1×108/mL的单细胞悬液备用。将骨髓细胞和脾细胞1:1混合。

1.2.4 造血干细胞移植：每只小鼠尾静脉输注100 μL细胞，总量为1×107个细胞（其中脾脏细胞和骨髓细胞各5×106个）。

1.2.5 移植效果判定标准：①移植失败：照射后小鼠很快就死亡，存活时间＜48 h，死亡时外周血白细胞数＜0.5×109/L。②造血衰竭：移植后白细胞数没有复升，死亡时白细胞数＜0.5×109/L。③aGVHD发生：白细胞数＞0.5×109/L，小鼠出现纳差，精神萎靡，活动度下降，嗜睡，皮肤溃疡、脱皮，血便、腹泻，体质量减轻，弓背，翘毛等症状。HE染色可观察到肝、脾、皮肤、小肠等靶器官内有淋巴细胞浸润，正常组织结构被破坏。④移植成功：白细胞数下降后复升，且连续3 d白细胞数＞1×109/L。

1.2.6 aGVHD临床评分标准[6]：体质量减轻（占原体质量的百分数）＜10%为0分，10%～25%为1分，＞25%为2分。体位正常为0分，不活动时弓背为1分，严重弓背影响活动为2分。活动情况正常为1分，轻度至中度减少为1分，刺激时才活动为2分。毛发正常为0分，轻度至中度翘毛为1分，翘毛明显，杂乱难以梳理为2分。皮肤正常为0分，爪部和尾部皮肤脱皮为1分，皮肤裸露明显为2分。临床评分为5项标准评分的总和，最高分数为10分，临床评分超过5分为重度，3～5分为中度，小于3分为轻度。

1.2.7 嵌合体检测：尾静脉取血，经红细胞裂解液裂解，用FACS缓冲液洗1次，加入1:500稀释的Anti-Mouse MHC I（H-2kb）IFTC和1:500稀释的Anti-Mouse MHC I（H-2kd）PE 20 μL，重悬后在4 ℃或者冰上避光孵育15 min，再用FACS缓冲液洗1～2次，重悬至200 μL的FACS缓冲液中，上机读样。

1.2.8 免疫组织化学LC3定位定量测定：取出小鼠的脾脏、肝脏、肺和小肠，经4%多聚甲醛溶液固定。分别经75%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水处理20～30 min；二甲苯透明30 min～1 h，待组织成透明状放置在60 ℃恒温箱中蜡罐里浸蜡20～30 min，然后包埋，切片，脱蜡，梯度水化，用PBS清洗2～3次，直至载玻片周围无蜡。此后，用0.01 mol/L枸橼酸缓冲液修复抗原，PBS清洗2～3次，用5%小牛血清在37 ℃下封闭30 min，用稀释1:100的anti-LC3孵育液4 ℃孵育过夜，第2天经PBS清洗后，DAB显色，再用苏木精染色，脱水，透明，封片，镜检。用免疫组织化学评分（immunohistochemical score，IHS）来计算LC3蛋白的表达水平。A表示阳性细胞评分，无被染色的阳性细胞记为0，1%～10%阳性细胞记为1，10%～50%阳性细胞记为2，50%～80%阳性细胞记为3，80%～100%阳性细胞记为4。B为阳性细胞染色强度，0为阴性，1为弱阳性，2为阳性，3为强阳性。IHS=A×B[7]。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料用±s表示，多组计量数据先进行正态性及方差齐性检验，满足条件的计量资料再进行独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 嵌合体鉴定 移植后第21天，取小鼠尾静脉血10 μL，经Anti-Mouse MHC I（H-2kb）IFTC和Anti-Mouse MHC I（H-2kd）IFTC染色，用流式细胞仪检测分析受鼠中供鼠细胞的植入情况。空白对照组小鼠的外周血流式细胞仪仅显示自身组织相容性抗原H-2kd（见图1A），表明未接受任何移植的原始状态；移植后小鼠均显示供鼠组织相容性抗原H-2kb大于95%以上（见图1B），表明骨髓移植成功。

图1 流式细胞术嵌合体检测结果

2.2 生存曲线 BM组小鼠第1例死亡时间是移植后第9天，中位生存期超过31 d，aGVHD组小鼠第1例死亡时间是移植后第6天，中位生存时间为17.6 d，ITF组小鼠第1例死亡时间是移植后第9天，中位生存时间为28 d。ITF组与aGVHD组比较，其第1例死亡时间和中位生存时间都明显延后。见图2。

图2 移植后各组小鼠生存曲线

2.3 移植后外周血白细胞变化 未移植前小鼠的外周血白细胞数为7～10×109/L（见图3），移植后小鼠白细胞数迅速降低，于移植后第6天降到最低，BM组、aGVHD组、ITF组小鼠的白细胞数分别为（1.62± 0.35）×109/L、 （0.88±0.23）×109/L、 （1.14± 0.30）×109/L，第6天之后BM组小鼠白细胞数迅速上升，并于第20天左右升至正常，观察结束时间第30天时白细胞数上升至（9.27±0.63）×109/L，aGVHD组小鼠白细胞缓慢上升，在第25天全部死亡，此时白细胞数为（5.70±0.42）×109/L，ITF组小鼠白细胞数中等程度持续增加，在第25天左右恢复正常，第30天时为（7.80±0.40）×109/L。

2.4 临床评分 临床评分评估移植后小鼠aGVHD的严重情况，主要与体质量减轻、体位、毛发和活动度相关。除BM组在第7天达到最高值，其余各组小鼠的临床评分均在第14天左右达到最高值，而后呈缓慢下降趋势（见图4）。BM组在第7天临床评分为1.8±0.4，aGVHD组小鼠同时期的临床评分为3.9± 0.3，较BM组显著增高（P＜0.01），表明骨髓移植模型建立成功，小鼠成功出现aGVHD症状。第14天，ITF组与aGVHD组比较，临床评分明显降低（4.3±0.4 vs. 5.9±0.4，P＜0.05），表明aGVHD临床表现缓解。2.5 自噬蛋白LC3蛋白免疫组织化学检测结果 同一时间不同组别进行比较，在第1、第2、第3、第4周，aGVHD组的LC3水平较BM组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。第1、第2、第3周，ITF组与aGVHD组比较，LC3表达水平下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。不同时间段同一组内小鼠LC3表达比较，BM组在第1周末达到高峰，而aGVHD组和ITF组均在第2周末达到高峰，随后逐渐降低。见图5、表1。

图3 移植后各组小鼠外周血白细胞计数

图4 移植后各组小鼠临床评分

图5 LC3在各组小鼠肠上皮的表达水平（×400）

表1 LC3的IHS在各时间点表达量的变化（n=3，±s）

表1 LC3的IHS在各时间点表达量的变化（n=3，±s）

与aGVHD组比：aP＜0.05，bP＜0.01

组别第1周第2周第3周第4周BM组159.60± 8.02b123.00± 6.00b105.00± 7.00b77.67±15.50aaGVHD组207.67± 7.02227.33±19.00176.67± 8.50117.33± 3.51 ITF组174.33±13.31a192.00± 9.00a147.33±11.10a106.33± 6.66

3 讨论

肠道损伤导致肠道黏膜完整性破坏，通透性增强，内毒素和病原体迁徙易位，引起全身性炎症反应，因此，预防和缓解移植后肠道炎症是改善GVHD预后的一个可行方案。近年来，ITF备受关注，它在受损的肠道黏膜治愈和修复方面起重要作用[8]。正常情况下，ITF主要由肠道杯状细胞、黏膜细胞、腺细胞分泌，通过抗凋亡、迁徙[9]、与黏蛋白相互作用形成肠道表面保护膜而发挥作用。本课题组前期研究证明，ITF可以通过促进肠道细胞迁移、抗凋亡等保护作用修复甲氨蝶呤对肠道黏膜的损伤[10]，还可以通过促进肠道受损黏膜的修复，保护肠道黏膜的完整性，从而对aGVHD起保护作用[3]。本研究通过建立aGVHD模型，预防性使用ITF灌胃治疗，观察到ITF组小鼠与aGVHD组小鼠比较，临床评分降低，移植后白细胞下降而后复升趋势变快，生存期明显延长，与前期研究结果一致。

研究发现肠道炎症反应与自噬有关。自噬是一种进化学上较为保守的细胞自我降解机制，胞质内的物质被转移双层膜结构的自噬溶酶体中，并被其中的溶解酶降解[11]。被细菌侵袭的肠道上皮细胞中自噬水平增高[5]。参与aGVHD早期“细胞因子风暴”的前炎症因子可以提高自噬水平[12]。自噬可以启动APC并激活供体T细胞，这是发生aGVHD的必要条件，而缺乏自噬基因的APC表现出处理、提呈抗原能力受损[13]和成熟障碍[14]。此外，缺乏Atg7、Atg3、Atg5的T模型中观察到T细胞更多的凋亡和更低的生存率[15]。以上研究结果说明，抑制自噬可以降低APC启动和增加效应T细胞的死亡，从而缓解全身性aGVHD症状。

溶酶体内LC3是反应自噬活动的标记蛋白，与自噬水平正相关[16]。因此本研究用LC3作为自噬水平的标记物，用免疫组织化学法对不同时期肠道内自噬水平进行定位定量的监测。结果发现，在小鼠移植模型中，各组小鼠LC3表达水平均增高，BM组在移植后第1周末达到自噬顶峰，而aGVHD组和ITF组在第2周末达到顶峰。这表明这3组小鼠在移植后由于预处理过程中放疗对肠道造成损伤，肠道上皮黏膜细胞受损，炎症因子释放，自噬水平增加。aGVHD组和ITF组自噬水平较BM组增加明显，且最高峰延迟，这可能是由于前2组比后组中增加了半相合的T细胞，外源性的T细胞攻击靶器官，从而引起自噬表达更持久，表达水平增加。ITF组较aGVHD组的小鼠LC3表达水平降低，aGVHD的全身症状得到缓解，这可能是由于ITF保护了肠道黏膜细胞，维护了肠道的屏障功能，降低炎症因子的释放，从而抑制肠道上皮细胞内的自噬，自噬水平的降低则抑制aGVHD中APC的提呈作用和效应T细胞的活动，从而缓解T细胞攻击靶器官的程度。

综上所述，ITF可能通过减少细胞因子分泌来降低自噬水平，从而降低aGVHD的APC以及T细胞的激活，缓解aGVHD症状。

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（本文编辑：丁敏娇）

Intestinal trefoil factor plays a protective role in acute graft versus host disease through aotophagy

CHEN Huiyao, ZHANG Wei, FANG Fang, HE Ying, ZHUANG Qiang, JIANG Songfu.

Department of Hematology, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To observe the protection of ITF in acute graft versus host disease (aGVHD) models, and to investigate the role of autophagy in the protective effect of ITF in aGVHD.Methods:aGVHD model was established from donor mice C57BL/6 (H-2b) to host mice BALB/C (H-2d). According to different treatment, mice were divided into 4 groups. No any treatment in control group, BM group only reveiced bone marrow transplantation, while aGVHD group

a combination of bone marrow and spleen cells, ITF group accepted prophylaxis ITF treatment on basis of aGVHD group treatment. The aGVHD level was evaluated by clinical scores, survival time, peripheral leukocyte counts and expression of LC3 by immunohistochemical staining.Results:The model of aGVHD was successfully established. Compared with ITF group, aGVHD group performanced earlier aGVHD symptoms, shorter survial time, lower peripheral WBC counts and higher aGVHD clinical scores (P＜0.05). Immunohistochemical staining (IHC) showed that aGVHD group had higher expression of LC3 compared with BM group and ITF group (P＜0.05).Conclusion:ITF play a protective role in aGVHD, which is associated with decrease of autophagy.

acute graft versus host disease; intestinal trefoil factor; autophagy; allogenic bone marrow transplantation; mice

R551.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.07.003

2017-03-16

浙江省自然科学基金资助项目（LY16H080006）。

陈慧瑶（1989-），女，浙江温州人，硕士。

江松福，副主任医师，副教授，硕士生导师，Email：jiangsongfu@189.cn。