齐墩果酸-阿司匹林缀合物促骨形成效果研究

吉璐宏 赵庭波

齐墩果酸-阿司匹林缀合物促骨形成效果研究

吉璐宏 赵庭波

目的 探讨齐墩果酸-阿司匹林缀合物对血清素合成的抑制活性以及促骨形成活性。方法 采用高效液相色谱和ELISA试剂盒测试齐墩果酸-阿司匹林缀合物对RBL-2H3细胞中血清素合成的关键酶色氨酸羟化酶-1(TPH-1)的抑制率及含量。构建去势大鼠骨质疏松症模型 (osteoporosis in ovariectomized rats,OVX)，并将骨质疏松大鼠随机分为齐墩果酸齐墩果酸-阿司匹林缀合物组、齐墩果酸和阿司匹林物理混合组、齐墩果酸组、阿司匹林物组、空白对照组 (OVX组)组、假手术组 (sham组)和阳性药物对照组，每组5只，给药35 d后采用高效液相色谱测试血清和小肠中血清素水平。采用MTT法测试缀合物对成骨细胞促进活性。结果 在RBL-2H3细胞中，齐墩果酸-阿司匹林缀合物对于TPH-1的抑制呈剂量依赖性，抑制率为11.9%～87.2%，其中缀合物3在10 μmol/L浓度下展现出了最高抑制率 (87.2%)，并能较空白组 (216 ng/ml)显著地降低TPH-1含量(65 ng/ml)，甚至略强于阳性药物组(69 ng/ml)。与假手术组 (sham组)相比，大鼠摘除卵巢 (OVX组)后血清和小肠中血清素的水平明显增高，而经过给缀合物后的大鼠血清和小肠中血清素的水平却明显降低，其中缀合物3降低血清素的活性或较齐墩果酸组和阿司匹林物组的2.3倍以上；此外，齐墩果酸-阿司匹林缀合物能够促进乳小鼠成骨细胞增殖。结论 本研究为开发齐墩果酸类抗骨质疏松类药物提供了新的思路。

齐墩果酸-阿司匹林缀合物；血清素；骨质疏松

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种在老年人和绝经后女性中最常见的骨科疾病，主要特征是骨量减少、骨密度降低、骨组织微结构退化，从而导致骨强度降低、骨脆性增加和易骨折[1]。与正常的组织一样，骨组织也存在着稳定的新陈代谢，即由成骨细胞行使骨形成和破骨细胞 (osteoclast,OC)行使骨吸收来维持骨的生理结构。正常情况下，骨形成的速度和骨吸收的速度大致相等，处于动态平衡。一旦这种平衡被打破，使得骨形成的速度低于骨吸收的速度就会导致骨质疏松症[2]。因此，目前治疗骨质疏松的药物可以分为促骨形成和抑制骨吸收两类[3]。但当前治疗骨质疏松的药物以骨吸收抑制 (如双膦酸盐、雌激素等)为主[3,4]，虽然这些药物能够有效的防止骨骼进一步流失，但只停留在改善症状，却没有达到逆转病情或治愈的效果。因此，开发出促进骨形成的药物已经成为抗骨质疏松药物研究的热点。然而令人遗憾的是，目前促进骨细胞形成类药物却只有甲状旁腺 (PTH-1)，而该药物能够增加患者骨肉瘤发病率的风险[5]。因此，开发出新型、高效、低毒副作用的促成骨细胞形成类药物具有重要的意义。

从天然产物中寻找和发现先导化合物已成为开发新药的重要途径。齐墩果酸 (Oleanolic acid)是一种五环三萜类化合物，以游离或糖苷的形式广泛的分布在多种植物中，并具有抗肿瘤、抗炎、降血糖等多种药理活性[6-8]，而且副作用小、毒性低，具有较大的临床应用价值。通过初步的研究我们发现齐墩果酸能够抑制肠源血清素(5-羟色胺,5-HT)，而血清素进入血液循环后通过抑制骨细胞分化和增殖进而减少骨形成[9-11]，因此，齐墩果酸是一类促有进成骨细胞形成的新型抗骨质疏松药物。近年来，老药新用也是新药开发的一个重点，例如阿司匹林 (Aspirin)是一个具有100多年历史的非甾体抗炎药，并具有较低的副作用，在这100多年里人们发现阿司匹林还能治疗偏头痛、老年痴呆症、结肠癌等多种新用途。最近研究发现阿司匹林还能够促进成骨细胞形成，提高骨密度的作用，具有抗骨质疏松的活性[12,13]。

基于齐墩果酸和阿司匹林展现出的促骨形成的药理活性，根据亚结构拼接和活性叠加的原理，我们将齐墩果酸和阿司匹林进行拼接以期得到活性更强、毒性更低的新型具有促骨形成作用的齐墩果酸衍生物。本研究探讨了齐墩果酸-阿司匹林缀合物 (图 1)对血清素合成的影响以及对骨细胞形成的作用。结果表明，测试的齐墩果酸-阿司匹林缀合物对肠源血清素均有抑制作用，其中缀合物3展现出了最强的活性，并能显著地促进成骨细胞增值。

图1 齐墩果酸、阿司匹林以及齐墩果酸-阿司匹林缀合物的化学结构

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 齐墩果酸、阿司匹林均购自北京百灵威科技有限公司，α-MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；齐墩果酸-阿司匹林缀合物由武汉大学刘远教授合成和结构确证；色氨酸羟化酶-1 (TPH-1) ELISA检测试剂盒购自武汉Cusabio公司；5-羟色胺 (5-HT)标准品购自上海生物科技有限公司；甲状旁腺激素 (PTH) 购自阿拉丁试剂有限公司；二甲基亚砜等其他试剂均为分析纯；RBL-2H3细胞株购自上海细胞典藏中心。动物：SD大鼠，体重200～250 g，雌性，由武汉大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SCXK (鄂) 2008-0004；动物级别：SPF级。

1.2 仪器 Agilent1200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；BP211D型电子天平(北京和悦达科技有限公司)；超净工作台(北京半导体设备一厂)；BB16/BB5060仪器CO2培养箱(上海力创科学仪器有限公司)；CKX31型倒置显微镜(奥林巴斯公司)；ELx800通用酶标仪 (美国BioTek公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 肠源性血清素合成抑制测试：取对数生长期的RBL-2H3细胞株悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，铺至48孔细胞培养板，在37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后加入不同浓度的测试药物，终浓度分别为2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，对照组仅加入溶剂DMSO (1 μl/ml培养液)，培养2 d后弃去培养液，用PBS洗涤，然后每孔加入100 μl RIPA强裂解液裂解细胞，再加入200 μl PBS稀释，离心后直接用HPLC测定血清素(5-羟色胺，5-HT)的峰面积，并计算出药物的对5-HT生物合成的抑制率。抑制率通过积分面积比可得，其计算公式为：抑制率(%)=100%-测试化合物峰面积/对照组峰面积。抑制率数值越大，表明缀合物对血清素的生物合成抑制作用就越强。

1.3.2 缀合物对RBL-2H3细胞毒性的MTT检测：取对数生长期的RBL-2H3细胞株悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，铺至96孔细胞培养板。待细胞完全贴壁后，弃去原培养液，加入100 μl的含有测试药物的培养液，终浓度分别为2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，在37℃、5% CO2培养箱中继续孵育2 d后，每孔加入30 μl 5 mg/ml MTT，继续孵育4 h，然后每孔加入100 μl二甲亚砜(DMSO)溶解。使用酶标仪在570 nm波长处测定每孔的吸光度(OD)值。

1.3.3 缀合物对TPH-1蛋白量的影响：首先用ELISA试剂盒，绘制TPH-1蛋白量-吸光度的标准曲线，再通过测试三萜类化合物与RBL-2H3细胞相互作用后的吸光度值计算出不同浓度缀合物对应的TPH-1蛋白量，从而确定化合物对TPH-1蛋白量的影响。取对数生长期的RBL-2H3细胞株悬浮于含10%胎牛血清DMEM培养基中，铺至24孔细胞培养板中。待细胞完全贴壁后，弃去原培养液，加入500 μl的含有测试药物 (对照组不加药物)的培养液培养2 d后，弃去培养液，并用PBS洗涤，然后将细胞反复的冻融，收集裂解液用ELISA试剂盒测试，使用酶标仪在450 nm波长处测定每孔的OD值。见图2。

图2 TPH-1含量的标准曲线

1.3.4 体内抑制血清素合成测试：将11周大的雌鼠分为给药组(30 mg·kg-1·d-1组)、空白组、阳性药对照组和假手术组，每组5只。在摘除卵巢造模术后第4天开始灌胃给药，其中阳性对照组腹腔注射20 g·kg-1·d-1的PTH，连续给药35 d后颈动脉取血。将血液在37℃下静置45 min后得到的血清用HPLC测试其血清素的含量；小肠则在酸化后测试其血清素，并用标准曲线定量。见图3。

图3 5-HT含量的标准曲线

1.3.5 促进骨细胞增值：无菌条件下将20只出生 2～3 d的乳小鼠处死，取出其头盖并刮去软组织，PBS清洗，剪碎后转移到培养瓶中，用混合酶 (0.25%胰酶+0.1%的Ⅱ型胶原酶=1∶1)，37℃消化15 min弃去上清液；再用0.1% 的Ⅱ型胶原酶消化5次，合并上清液并用培养基终止消化，将上清液用200目滤网过滤，2 000 r/min离心5 min收集细胞，将收集到的细胞接种到培养瓶中培养4 d，洗去未贴壁的细胞，剩下的细胞即为成骨细胞；接着，取对数生长期的成骨细胞悬浮于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中，铺至96孔细胞培养板。待细胞完全贴壁后，弃去原培养液，加入不同浓度的测试药物，终浓度分别为2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L，对照组仅加入溶剂DMSO (1 μl/ml培养液)，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育2 d后弃去培养液，每孔加入30 μl 5 mg/ml MTT，继续孵育4 h，然后每孔加入100 μl二甲亚砜(DMSO)溶解。使用酶标仪在570 nm波长测定每孔的吸光度(OD)值。

2 结果

2.1 体外抑制血清素合成的性 与齐墩果酸、阿司匹林和齐墩果酸+阿司匹林混合组相比，缀合物抑制血清素的能力明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，呈剂量依赖性；与阳性药物LP533401相比，缀合物在5 μmol/L和10 μmol/L的浓度下抑制血清素的能力明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 体外抑制血清素合成的抑制活性 与齐墩果酸、阿司匹林和齐墩果酸+阿司匹林混合组相比，目标缀合物对RBL-2H3细胞均没有明显的毒性,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 齐墩果酸-阿司匹林缀合物抑制肠源性血清素的合成作用 ±s

注：齐墩果酸+阿司匹林为摩尔比1∶1混合给药；与OA组比较，*P<0.05；与阿司匹林组比较，#P<0.05；与OA+阿司匹林混合组比较，△P<0.05

组别Inhibition(%)2．5μmol/L5μmol/L10μmol/L空白组0．0±0．030．0±0．040．0±0．02齐墩果酸1．4±0．17∗3．2±0．61∗5．2±0．78∗阿司匹林1．1±0．09∗2．4±0．27∗4．2±0．45∗齐墩果酸+阿司匹林a1．3±0．15∗2．8±0．22∗4．6±0．69∗12．5±0．41∗3．1±0．84∗3．9±0．82∗23．0±0．62∗4．2±1．25∗5．4±0．93∗32．8±1．07∗3．5±0．44∗4．2±0．51∗42．1±0．72∗3．9±0．99∗4．9±1．36∗51．7±0．34∗2．9±1．73∗5．1±1．65∗LP5334014．8±1．81∗5．5±1．57∗6．2±1．28∗

注：齐墩果酸+阿司匹林为摩尔比1∶1混合给药；与空白组比较，*P<0.05

2.3 齐墩果酸-阿司匹林缀合物对TPH-1蛋白量的影响 与空白对照组相比，缀合物在10 μmol/L的浓度下能明显地抑制TPH-1蛋白生成，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3,图4。

组别览TPH⁃1含量空白组216±12齐墩果酸177±10∗阿司匹林192±15∗齐墩果酸+阿司匹林a146±10∗1104±9∗ 2127±6∗ 365±5# 4112±6∗ 573±4# LP53340169±3#

注：齐墩果酸+阿司匹林为摩尔比1∶1混合给药；与空白组比较，*P<0.05，#P<0.01

2.4 缀合物对OVX大鼠血清和肠中血清素的影响 与假手术组(Sham)相比，OVX组血清和小肠中血清素水平均显著地升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与卵巢切除组相比，缀合物在10 μmol/L的浓度下能明显地降低血清和小肠中血清素水平，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。见表4,图5。

2.5 缀合物促进成骨细胞增殖 与空白对照组比较，缀合物显著地抑促进成骨细胞增殖，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。见表5,图6。

图4 齐墩果酸-阿司匹林缀合物对TPH-1蛋白量的影响。每组数据都是平均值±SD,n=3.*P<0.05,#P<0.01 vs 空白对照组

表4 齐墩果酸-阿司匹林缀合物抑制体内血清素的合成 ±s

注：齐墩果酸+阿司匹林为摩尔比1∶1混合给药；与假手术组比较，*P<0.05；与卵巢切除组比较，#P<0.05，△P<0.01

3 讨论

骨质疏松症是由于骨吸收超过骨形成所致，因此促进成骨细胞的活性是治疗骨质疏松症的重要方法。本研究以色氨酸羟化酶-1(TPH-1)为靶点，探讨了齐墩果酸-阿司匹林缀合物抑制肠源性血清素合成的活性以及成骨细胞的活性。从表1中可以看出这些齐墩果酸-阿司匹林缀合物对血清素均有抑制作用，其抑制率为11.9%～87.2%，强于先导化合物齐墩果酸和阿司匹林，并呈剂量依赖关系；与齐墩果酸和阿司匹林的物理混合组相比，这些通过化学合成的缀合物对血清素的抑制作用明显地高于物理混合组 (抑制率< 9%)，尤其是缀合物3在10 μmol/L的浓度下对血清素的抑制作用最强，抑制率高达87.2%，分别是齐墩果酸 (抑制率7.1%)和阿司匹林 (抑制率4.5%)的12和14倍，甚至高于阳性药物LP533401(抑制率84.6%)。但是，缀合物之间却有较大的差异。从结构上看，缀合物1是将阿司匹林的羧基拼接在齐墩果酸的C3位羟基上，其在10 μmol/L的浓度下对血清素展现出了中等的抑制作用，而将阿司匹林的羧基拼接到齐墩果醇C17羟基 (缀合物2)后却显著地降低了活性 (缀合物1 vs 2)，然而将阿司匹林的羟基拼接到齐墩果酸C17位羧基 (缀合物3)上却明显地增加了活性 (缀合物2 vs 3)，这些说明结果齐墩果酸C17的羰基是一个药效团，能够增加对血清素抑制活性；同时，比较缀合物1 和3可以发现，将阿司匹林拼接在齐墩果酸C17位的活性要高于在C3位。继续将在缀合物2的C3位羟基引入另一分子阿司匹林 (缀合物4)能够提高活性，但仍然低于缀合物3，同样地在缀合物3的C3位羟基继续引入另一分子阿司匹林 (缀合物5)也没有显著地提高活性，这些结果说明齐墩果酸C3位羟基不是药效团，对其修饰并不能显著地提高活性。进一步研究发现五环三萜类化合物对血清素的抑制活性不是来源于其对RBL-2H3细胞的毒性，而是来源于其对TPH-1的抑制活性，并能够明显地抑制TPH-1蛋白含量，并呈剂量依赖性。在动物水平上，大鼠摘除卵巢后血清和小肠中的血清素的水平均显著地增高(卵巢切除组vs 假手术组)，而经过缀合物给药后的大鼠血清和小肠中的血清素水平却明显地降低，其抑制血清素的作用也强于齐墩果酸、阿司匹林和齐墩果酸与阿司匹林混合物，其中缀合物3抑制血清素作用甚至强于阳性药物LP533401。这些结果说明缀合物在动物体内也能够抑制血清素的合成。在促进成骨细胞活性实验中，目标缀合物也能够显著地促进乳小鼠成骨细胞增殖，其中缀合物3展现出了最强的活性。

假手术组(sham)摘除卵巢大鼠

图5 齐墩果酸-阿司匹林缀合物抑制体内血清素的合成；(A)和(B)分别为假手术组 (Sham)与摘除卵巢大鼠血清和小肠的血清素水平；每组数据都是平均值±SD,n=5；与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.01;△P<0.01

表5 齐墩果酸-阿司匹林缀合物促进成骨细胞增殖效果 ±s

注：齐墩果酸+阿司匹林为摩尔比1∶1混合给药；与空白组比较，*P<0.05

图6 齐墩果酸-阿司匹林缀合物促进成骨细胞增殖效果；每组数据都是平均值±SD,n=3；与空白对照组比较，*P<0.05

综上所述，齐墩果酸-阿司匹林缀合物能够有效地抑制肠源性的血清素的合成并促进成骨细胞形成，尤其是缀合物3在体外和动物体内均展现出了对血清素合成最强的抑制活性以及促进成骨细胞增殖活性。对于齐墩果酸-阿司匹林缀合物促进成骨的具体作用机制还有待进一步研究。

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Experimental study of the effects of oleanolic acid-aspirin conjugates on bone formation

JILuhong,ZHAOTingbo.

DepartmentofOrthopaedics,TheFirstHospitalofXiantaoCity,Hubei,Xiantao433000,China

Objective To investigate the effects of oleanolic acid-aspirin conjugateson in inhibiting serotonin biosynthesis and promoting bone formation. Methods The inhibitor rate and contents of oleanolic acid-aspirin conjugates on tryptophan hydroxylase 1 (TPH-1) in RBL-2H3 cells,which was the principal enzyme in biosynthesis of serotonin,were detected by HPLC and ELISA kit. The rat models with osteoporosis were established by ovariectomy (OVX). Then the rats were randomly divided into oleanolic acid-aspirin conjugates group, oleanolic acid+aspirin group, oleanolic acid group (OA group),aspirin group,blank control group (OVX group),sham operation group (sham group) and positive drug control group,with 5 rats in each group. After 35-day medication,the levels of serotonin in serum and small intestine were detected by HPLC method,and the osteoblasts activities of promoting osteoblasts proliferation of oleanolic acid-aspirin conjugates were evaluated by using MTT assay.Results As compared with that in OA group, aspirin group and OA+aspirin group, the inhibitory ability on serotonin in oleanolic acid-aspirin conjugates group was significantly increased (P<0.05),with a dose-dependent manner. As compared with that in positive drug control group (LP533401), the inhibitory ability on serotonin in oleanolic acid-aspirin conjugates group at the concentration of 5μmol/L and 10μmol/L was significantly increased (P<0.05). As compared with OA group, aspirin group,OA+aspirin group, and oleanolic acid-aspirin conjugates group had no obvious toxicity on RBL-2H3 cells (P>0.05). As compared with OVX group,the oleanolic acid-aspirin conjugates group at the concentration of 10μmol/L could obviously inhibit the TPH-1 protein production (P<0.05). As compared with those in sham operation group, the levels of serotonin in serum and small intestine in OVX group were significantly increased (P<0.05). As compared with OVX group, the oleanolic acid-aspirin conjugates group at concentration of 10μmol/L could obviously decrease the levels of serotonin in serum and small intestine of rats (P<0.05).Moreover,as compared with OVX group, the oleanolic acid-aspirin conjugates could significantly inhibit osteoblasts formation (P<0.05). Conclusion The research results provide an new idea for development of anti-osteoporosis drugs like OA.

oleanolic acid;aspirin conjugate; serotonin; osteoporosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.004

433000 湖北省仙桃市第一人民医院骨外二科

R 336

A

1002-7386(2017)15-2258-06

2016-11-11)