猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立与初步应用

彭旺，唐小明，葛猛，杨涛涛，屈泰龙，余兴龙*

(1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南省动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410007)

猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立与初步应用

彭旺1，唐小明2，葛猛1，杨涛涛1，屈泰龙1，余兴龙1*

(1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南省动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410007)

以分离的猪萨佩罗病毒PSV HuN1/2016株感染PK15细胞，制备抗原板，建立检测猪血清中PSV 抗体的间接免疫荧光(IFA)方法。结果表明：一抗最佳稀释浓度为1∶300；FITC标记的羊抗猪荧光二抗最佳稀释浓度为1∶300。该方法特异性强，敏感度高，既能将PSV抗体与PRRSV、FMDV、PCV、CSFV抗体区分开，也可以检测到中和效价 0.128的阳性血清。用该方法检测湖南省部分规模化猪场 208份临床血清样品的总阳性率为68%，表明PSV在湖南省流行普遍，且其感染主要发生在保育阶段。

猪萨佩罗病毒；间接免疫荧光；抗体检测；湖南

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus, PSV)是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科萨佩罗病毒属[1]。PSV曾被命名为PEV-8，被归类为猪肠道病毒A(PEV-A)[2]。因PSV病毒特有的L蛋白和结构高度特异的 2A 基因及 5′端非编码区(UTR)能将其与其他的肠道病毒区分开，后来将其归类为一个新的属[3-4]，2009年，国际病毒分类委员会(ICTV)正式将猪肠道病毒A(Porcine enterovirus A)更名为猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus)[1]。萨佩罗病毒属包含猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus)、禽萨佩罗病毒(Avian sapelovirus)和猿萨佩罗病毒(Simian sapelovirus)。猪萨佩罗病毒只有一个血清型，家猪和野猪均可感染[5]，且感染猪只康复后依然会继续排毒，成为重要的病毒传染源[6]，因此，该病毒在饲养的猪群中感染率很高[7]。该病毒最早于1960年在英国被发现[8]，随后在加拿大、日本、澳大利亚等世界范围内的其他国家相继报道[9-11]。PSV可引起猪脑脊髓灰质炎、肺炎、繁殖障碍、心包炎、心肌炎、皮肤损伤、腹泻等多系统综合征，同时也可出现无明显特征的亚临床症状[12]。无论 PSV以何种形式存在，都对养猪业具有潜在的危害。

PSV的实验室诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定、RT-PCR等，但这些方法主要用于检测病原，且对试验条件和技术要求较高。目前还没有关于猪萨佩罗病毒血清流行学方法的报道，还很难准确认识本病在猪群中的流行与感染情况。本研究中以实验室分离的猪萨佩罗病毒 PSV HuN1/2016株为标准制备细胞抗原板，建立检测猪血清中PSV抗体的间接免疫荧光(IFA)方法，旨在为 PSV的血清流行病学调查提供一种高敏感度和高特异性的检测方法。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞

PSV HuN1/2016分离株(GenBank登录号为KX354740)、PK15细胞由湖南农业大学动物医学院动物微生物免疫实验室分离与保存。

1.2 血清

PSV阴性血清采集于健康生长的猪。PSV阳性血清采集于受 PSV病毒感染的猪。经中和试验验证，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒 2型(PCV-2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性而PSV阴性的抗体的由1.1中实验室制备与保存。临床血清样品采自湖南省长沙、株洲、岳阳、邵阳等地的6个规模化猪场。

1.3 主要试剂

羊抗猪IgG荧光二抗(FITC-IgG)为KPL公司产品；多聚甲醛、伊文思蓝和无荧光甘油均为中国产品。

1.4 抗原板的制备

将 PK15细胞于 96孔板培养至单层后接种200TCID50PSV HuN1/2016，以未接毒细胞为对照。当20%细胞出现病变后弃去培养液，PBST洗涤后用4%多聚甲醛室温固定20 min，-20 ℃保存，备用。

1.5 间接免疫荧光法(IFA)

将已固定的细胞抗原板用PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加入10%山羊血清，37 ℃封闭2 h，弃掉封闭液，每孔加入100 μL稀释的血清，4 ℃孵育12 h。PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加入100 μL稀释的羊抗猪IgG荧光二抗，37 ℃作用30 min。PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加入50 μL 0.01%伊文思蓝水溶液，室温染色20 s，PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加入30 μL无荧光甘油封底，用荧光倒置显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 血清和荧光二抗的最佳稀释度

用0.01 mol/L pH7.4的PBS缓冲液将阳性和阴性血清按1∶100、1∶200、1∶300、1∶400稀释，荧光二抗按 1∶100、1∶200、1∶300、1∶400稀释。根据方阵试验确定血清最佳稀释度为1∶300，荧光二抗最佳稀释度为1∶300。在荧光显微镜下，阳性血清孔可见细胞浆内和膜上有绿色荧光染色(图1-A)，阴性血清孔没有非特异性荧光染料附着，且在伊文思蓝染色下呈红色(图 1-B)。以此为标准对被检测的血清进行判定。

图1 PSV间接免疫荧光法检测血清的阴性和阳性结果(20×10)Fig.1 Reaction of antibodies from serum samples against PSV detected by IFA(20×10)

2.2 特异性试验结果

用PRRSV、FMDV、PCV-2和CSFV抗体进行交叉性试验，确定抗原板的特异性。结果显示：4种参考阳性血清检测孔均未见任何特异性荧光，表现为阴性，表明该方法具有很好的特异性。

2.3 敏感度试验结果

将 PSV 阳性血清(中和效价为 1∶128)依次做1∶10、1∶100、1∶1 000的10倍梯度稀释，进行间接免疫荧光敏感度试验。结果显示：当阳性血清稀释到1∶1 000时，血清检测孔仍然有特异性荧光，表明该方法可以检测到中和效价0.128的阳性血清。

2.4 对临床血清样品的检测结果

用该方法对湖南省6个规模化猪场(记为A、B、C、D、E、F)208份临床血清样品进行检测，结果显示：有142份样品为阳性，样品总阳性率为68%，表明PSV在湖南省流行普遍。

表1 临床样品的检测结果Table 1 Results on clinic serum samples detected by IFA

3 结论与讨论

对PSV的检测目前主要以RT-PCR病原检测为主，但RT-PCR检测容易出现假阳性，且组织中病毒含量低时难以检测出结果，检测出的感染率可能会低于实际感染率。RT-PCR病原检测也不适于曾经感染病毒但病毒已在猪体内消失的情况，而针对抗体检测的免疫荧光方法可有效解决这一问题，有利于更加全面和系统地了解PSV的流行情况。

在本试验 PSV抗体的间接免疫荧光方法建立过程中，将参考阳性血清稀释到1 000倍时仍然能够检测到特异性荧光，但将弱阳性血清稀释400倍时的检测结果与阴性结果相差不大，而当血清稀释倍数小于200倍时，部分检测血清存在一定程度的非特异性荧光干扰，这可能与猪血清的非特异性吸附[13]有关，因此，临床大批量检测的血清最佳稀释倍数为300倍。在减少非特异性荧光干扰试验中，用10%山羊血清作为封闭液比用5%脱脂奶粉封闭液的效果好，推测这与本试验中使用与荧光二抗羊抗猪来源同系的非免疫血清封闭有关。此外，本研究中建立的检测 PSV抗体的间接免疫荧光方法与PRRSV、FMDV、PCV-2和PRV抗体无交叉反应，具有很好的特异性。

用建立的检测方法检测湖南省6个规模化猪场的208份临床血清样品，其中有142份样品为阳性，样品总阳性率为68%。进一步分析不同年龄阶段猪群的 PSV抗体情况，结合 1.1中实验室建立的ELISA方法检测不同日龄猪血清的检测结果，仔猪群的阳性率低，保育猪的阳性率升高，育肥猪的阳性率居高不下，依此可以推测PSV的感染规律：哺乳仔猪群因有母源抗体保护，抗体保护力较强；断奶后随着母源抗体消退，抗体保护力减弱；保育阶段猪群出现PSV感染，育肥阶段猪群抗体阳性率居高不下，表明PSV抗体在猪体内维持的时间比较长。

目前关于PSV血清学研究的报道尚少。本研究中建立的适用于快速、大批量检测猪血清中PSV抗体的间接免疫荧光检测方法，可为PSV血清流行病学研究提供参考。

参考文献：

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[3] KRUMBHOLZ A，DAUBER M，HENKE A，et al.Sequencing of porcine enterovirus groups II and III reveals unique features of both virus groups[J]. J Virol，2002，76(11)：5813-5821. DOI：10.1128/jvi.76.11.5813-5821.2002．

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[13] 朱兆奎，张曦，滕峥，等. 猪乙脑病毒 IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用[J]. 中国人兽共患病学报，2006，22(2)：150-152. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2006.02.013．

责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Establishing the indirect immunofluorescence assay for antibody detection from Porcine sapelovirus

PENG Wang1, TANG Xiao ming2, GE Meng1, YANG Taotao1, QU Tailong1, YU Xinglong1*
(1.College of Veterinary Medicine, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2.Animal Disease Control Center of Hunan Province, Changsha 410007, China)

Indirect immunofluorescence assay (IFA) for detecting antibody of Porcine sapelovirus (PSV) from porcine serum was established by employed the strain PSV HuN1 cultured in PK-15 cells as antigen coating in plate. The primary antibody and fluorescent secondary antibody in the test were diluted to 300 times. The results showed that the approach not only had high specificity and sensitivity which could discriminate PSV from other porcine virus antigens(such as PRRSV, FMDV, PCV, and CSFV), but also could detect positive serum sample with concentration low to 0.128 SN titer. The fact detected by the established method that 68% samples out of 208 serums from commercial farms scattered in Hunan province were positive indicated that the PSV was widely prevalent in the region, and the infection was mainly occurred in the weaning period.

Porcine sapelovirus; indirect immunofluorescence assay; antibody detection; Hunan province

S858.28

A

1007-1032(2017)04-0423-04

2017-02-20

2017-03-11

彭旺(1991—)，男，湖南衡阳人，硕士研究生，主要从事动物病原分子学与免疫学研究，xuyi2030@163.com；*通信作者，余兴龙，博士，教授，主要从事动物病原分子学与免疫学研究，xlyu999@126.com