宽体金钱蛭新鲜药材抗凝血有效成分分析※

刘 君张丽艳

宽体金钱蛭新鲜药材抗凝血有效成分分析※

刘 君1张丽艳2

目的对中药水蛭品种之一的宽体金钱蛭鲜品药材中抗凝血的活性成分进行提取、分离及纯化，并进行抗凝活性检测。方法采用凝胶色谱等方法对活性成分进行提取、分离及纯化；采用HPLC对单体蛋白进行纯度检查；采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和质谱法测定蛋白单体的分子量；通过单体蛋白对家兔全血凝固时间的影响和对家兔血浆复钙时间的影响进行抗凝血活性检测。结果从宽体金钱蛭新鲜药材中分离出3个蛋白质单体，分子量分别为12042.57 Da、15580 Da、24416 Da，经检测有两个蛋白单体具有抗凝血活性。结论从非吸血类水蛭药材的宽体金钱蛭体内也可分离出具有抗凝血作用的活性物质。

水蛭；宽体金钱蛭；抗凝血有效成分；新鲜药材；分离；纯化

世界上蛭类有300多种，在我国约有近百种。水蛭为传统中药，始载于《神农本草经》。中国药典（2015版）收载3种水蛭，分别是水蛭、尖细金钱蛭及宽体金钱蛭[1]。现代研究表明，水蛭品种间存在较大种间差异，因食性不同，水蛭品种间的化学成分和药理活性存在差异[2]。水蛭按食性可以分为吸血蛭类和非吸血蛭类，吸血蛭类主要靠吸吮动物血液为生，这类水蛭主要有日本医蛭、欧洲医蛭、菲牛蛭等[3]。中华人民共和国药典（2015版）中的水蛭就属于吸血类水蛭，目前的研究多集中于吸血类水蛭。吸血蛭类具有良好的抗凝血活性，其抗凝血的主要成分为水蛭素及其异构体[4]。非吸血蛭类不吸食动物血液，是以捕食水中小动物及吸吮螺体、蚌壳的体液为生[5]。中华人民共和国药典（2015版）中的宽体金钱蛭和尖细金钱蛭就属于非吸血类水蛭。有研究表明，非吸血类水蛭的抗凝血酶活性与吸血类水蛭有较大差别[6]。但有研究表明，宽体金钱蛭具有抗凝血、抗血栓形成、抗血小板聚集等药理作用[7]。本研究就宽体金钱蛭新鲜药材的抗凝血有效成分进行分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验药材 新鲜宽体金钱蛭药材（江苏微山湖，经辽宁中医药大学鉴定教研室翟艳君教授鉴定为宽体金钱蛭）。

1.2 仪器与试剂 LC-10 A高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；美国Agilent公司1100系列SL离子阱质谱仪，配有ESI源；DEAE sephadex A-50、SephacryS-200 High Resolution、Sepharose 6 FastFlow（上海钰博生物科技有限公司）。

1.3 实验动物 白兔，由沈阳医学院实验动物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 抗凝血活性成分提取分离 取宽体金钱蛭新鲜药材，加0.9%氯化钠注射液提取2次，第1次6倍量，静置2 h（冷藏），第2次4倍量，静置1 h（冷藏），离心（4000 rpm），合并2次提取的上清液，用70%硫酸铵[（NH4）2SO4]沉淀，离心（4000 rpm），沉淀以少量纯水溶解，采用Sephadex G -25柱脱盐，收集洗脱液浓缩，浓缩液通过Sepharose 6 Fast Flow色谱柱，以0.2 mol/L（pH=6.8）的磷酸盐缓冲溶液洗脱，收集具有抗凝活性的有效部位，再通过DEAE-SephadexA-50色谱柱进行纯化。

1.4.2 分子量测定

1.4.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE） 试验方法参照文献[8]，扫描定位法测定溴酚兰指示剂和蛋白迁移距离。

1.4.2.2 质谱法（MS） MH-A的SDS-PAGE检测结果小于14400 Da（即在标准分子量范围之外），采用SDS-PAGE方法无法测定其相对分子量，故采用MS测定MH-A的分子量。质谱条件：ESI源正离子模式；雾化气流速：70 L/h；干燥气流速：427 L/h；干燥气温度：150 ℃；采集质量范围：100～900 m/z；多极扫描碰撞气：氦气；溶剂：（+）0.5%甲酸，（-）0.5%氨水。

1.4.2.3 抗凝活性检测 ①对家兔全血凝固时间的影响：从兔的颈总动脉插管采血。采用试管法，设实验组和对照组，对照组采用0.9%氯化钠注射液。取试管20支，先分别加入以上分离得到的3种蛋白质单体溶液及0.9%氯化钠注射液各0.1 ml，每个样品5支，再每管加入新鲜兔血0.9 ml，立即开始计时。置（37.0±0.5）℃恒温水浴中，每隔15秒钟倾斜1次，观察血液是否凝固，至血液成为冻胶状不再流动为止，记录各管凝固时间。

②对家兔血浆复钙时间的影响：血浆制备：采集血液样本，置于含有适量抗凝剂（8%枸橼酸钠溶液）的试管内，抗凝剂与血液容积之比为1:9，缓慢摇动试管12次，以混匀血液，确定试管已封闭，避免样本在离心过程中蒸发，以3000 rpm离心10 min（血样采集后1 h之内进行），将上层血浆分装出来。

③测试方法：取试管20支，依次每管加入待测样品及1%氯化钙溶液，对照组加入0.9%氯化钠注射液，每组样品及对照组各5支，每管分别加入一定量血浆。氯化钙溶液、待测样品、血浆加入量分别为0.1 ml、0.4 ml、0.5 ml，立即混匀，开始计算时间，每隔15秒钟倾斜1次，观察血液是否凝固，至血浆成为冻胶状不再流动为止，记录各管凝固时间。

2 结果

2.1 分离得到的蛋白质组分 分离得到3个蛋白质组分，分别命名为MH-A、MH-B、MH-C。经电泳检测为单一化合物，SDS-PAGE方法的分子量测定结果为：MH-B相对分子量为15580D a；MH-C相对分子量为24416 Da。MH-B、MH-C相对分子量检测电泳图谱分别见图1、图2。MH-A的质谱分析分子量为12042.57 Da，见图3。

图1 MH-B电泳图谱

图2 MH-C电泳图谱

图3 MH-A质谱图

2.2 抗凝活性检测结果 加入MH-B、MH-C的家兔全血凝固时间与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；加入MH-A的家兔全血凝固时间与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 单体蛋白对家兔全血凝固时间的影响

加入MH-B、MH-C的家兔血浆复钙时间与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；加入MH-A的家兔血浆复钙时间与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

试验结果初步表明，MH-A无明显抗凝血活性；MH-B、MH-C有明显的抗凝血活性，MH-B作用较显著。

表2 单体蛋白对血浆复钙时间的影响

3 讨论

水蛭是中医临床上较为常用的活血化瘀药物，其药性咸、苦，平，有小毒，归肝经，具有破血通经、逐瘀消癥之功效。因其疗效卓著而倍受历代医家赞益。从吸血类的水蛭分离得到数种具有抗凝血活性的化学成分，其中最为典型的为水蛭素及其异构体。水蛭素是从吸血类水蛭的唾液腺分泌液中分离的一种具有抗凝血作用的多肽，是目前发现的、最强的天然凝血酶抑制剂，作用强于肝素，而且不易引起出血。天然水蛭素是由65或66个氨基酸组成的单链多肽，相对分子量为7000，水蛭素的形状类似蝌蚪，蝌蚪头部是多肽的N端，富含半胱氨酸（cys），cys相互作用形成3个二硫键（Cys6- Cys14、Cys16-Cys28、Cys22-Cys39），使N端结合紧密，其C端含有6个酸性氨基酸。水蛭素的N末端能封阻凝血酶与纤维蛋白原专一性作用的阴离子结合位点R，而C末端的酸性氨基酸可以与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。N末端和C末端两个功能区域以协同的方式结合到凝血酶上，在凝血酶的活性部位形成一个帽子，阻止凝血酶与底物结合[9]，从而发挥抗凝血作用。由于水蛭素的稳定性高，在极端和热条件下均能保持活性，而且抗凝作用强，因此在医学上有着广泛的应用前景。1986年，重组水蛭素成功合成，相比天然水蛭素，其活性略低，但其他性质基本相同。

而在非吸血水蛭中，是否存在抗凝血活性成分，其活性成分的作用机制是什么，是目前许多学者关注的问题。

现代研究表明，宽体金钱蛭具有抗血小板聚集、抗凝血、抗血栓形成、改善血液流变性等药理作用[7]。在中医临床上，水蛭药用的主要品种就是宽体金钱蛭，占70%～80%。为了进一步探讨其药效物质基础，本研究对宽体金钱蛭抗凝血的活性成分进行了分离和纯化，从宽体金钱蛭中分离出3个蛋白质单体，体外凝血实验表明，有二个蛋白质单体具有抗凝血活性。

水蛭药材在夏、秋二季采集后通常是以沸水烫死后，晾干或低温干燥，药典法定的炮制方法是滑石粉烫。在加工炮制过程中，水蛭中的化学成分尤其是蛋白质及肽类成分的结构及生物活性会发生改变[10]。本研究采用新鲜宽体金钱蛭药材，即秋季捕捉后洗净，置-20 ℃冰箱中冷冻保存备用。中医临床一般是采用干品药材或炮制品入药，经高温处理后的水蛭临床使用仍然有较好的疗效，为了更好的探讨宽体金钱蛭临床药用的物质基础，应当进一步的研究其干品药材的化学成分和干燥及炮制前后其有效成分的变化，以及由此产生的药理活性的变化，以便指导临床用药。另外，对其活性成分的结构测定及作用机制研究也有待于进一步探讨。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2015:50-51.

[2] 李颖,袁继伟,焦跃军.入药水蛭品种探析[J].中国中医药咨讯,2010,2(2):97.

[3] 张彬,汪波,龚元,等.几种水蛭抗凝血物质提取及活性分析[J].中山大学学报(自然科学版),2012,51(4):92-96.

[4] 邓妙丽,李宝红,程怡,等.水蛭的研究概况[J].海峡药学,2012,24(3):5-8.

[5] 张汉贞,聂诗明,张丽萍,等.不同食性的水蛭抗凝血酶活性的比较[J].中药材,1998,21(12):599-600.

[6] 梁进权,王宁生,宓穗卿.水蛭抗凝抗血栓活性及其与品种、提取方法的关系[J].中西医结合心血管病杂志,2009,7(9):1096-1098.

[7] 杨洪雁,杜智恒,白秀娟.水蛭药理作用的研究进展[J].东北农业大学学报,2012,43(3):128-133.

[8] 陈彦琳,杜杰,白宗利,等.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)比较加热前后蛋白成分的变化[J].世界科学技术(中医药现代化),2010,12(6):948-951.

[9] 林晓洋.天然水蛭素分离纯化研究[D].南宁:广西大学,2007:6-7.

[10] 刘丽芳,金蓉鸾,徐国钧,等.中药水蛭经炮制后的成分变化研究[J].中成药,2001,23(12):880-882.

Study on anticoagulant components in fresh Whitmania pigra Whitman

Liu Jun Zhang Yanli

ObjectiveExtract, separate,purify and detect the active components in fresh Whitmania pigra Whitman.MethodsAdopt gel chromatography to extract,separate,purify;adopt HPLC to test purity;adopt SDS-PAGE and MS to determine the molecular weight; detected preliminarily anticoagulant activity by effect on rabbit whole blood clotting time and effect on rabbit plasma recalcification time.ResultsSeparated three proteins from fresh Whitmania pigra Whitman,the molecular weight are 12042.57Da、15580Da、24416Da,two proteins have anticoagulant activity.ConclusionThere are anticoagulant components in Whitmania pigra Whitman of no blood sucking Hirudo.

Leech;Whifmania pigra;Anticoagulant active ingredient;Fresh medicinal materials;Isolation;Purification

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.06.006

1辽宁省中医药研究院临床药理实验室，辽宁沈阳 110034

2辽宁中医药大学基础医学院，辽宁沈阳 110032

辽宁省教育厅课题项目（编号：2006B058）

刘君（1971-），博士学位，副研究员。研究方向：中药药效物质基础研究