参地颗粒治疗慢性肾炎脾肾亏虚证的疗效及免疫机制研究❋

魏 玲，金 华，王亿平△，茅燕萍，张 磊

(1.安徽中医药大学第一附属医院，合肥 230031；2.安徽中医药大学，合肥 230031)



【临床基础】

参地颗粒治疗慢性肾炎脾肾亏虚证的疗效及免疫机制研究❋

魏 玲1，金 华1，王亿平1△，茅燕萍1，张 磊2

(1.安徽中医药大学第一附属医院，合肥 230031；2.安徽中医药大学，合肥 230031)

目的：观察参地颗粒对慢性肾炎脾肾亏虚型患者Th17细胞免疫功能的干预作用。方法：90例慢性肾炎患者按随机数字表法分为试验组和对照组各45例，2组均给予西医基础治疗，对照组加用缬沙坦胶囊(代文)80 mg/d，试验组在对照组基础上加用参地颗粒，2组疗程均为12周。观察24 h尿蛋白定量(24 hUpro)、尿红细胞计数(URBC)，并采用流式细胞技术检测外周血CD4+、CD8+和Th17细胞含量，酶联免疫吸附法检测血清白介素-17(IL-17)水平。结果： 试验组疾病疗效总有效率显著高于对照组。试验组治疗后24 hUpro、URBC与治疗前比较均显著降低，且24 hUpro亦显著低于同期治疗后的对照组。试验组治疗后的Th17含量及IL-17水平与治疗前比较均有显著降低，CD4+、CD4+/CD8+比值显著提升，且其CD4+/CD8+比值、Th17含量及IL-17水平变化与对照组比较亦差异有统计学意义。结论： 参地颗粒可以通过调节Th17细胞功能，从而改善慢性肾炎脾肾亏虚型患者的免疫功能，发挥临床疗效。

慢性肾炎；参地颗粒；T淋巴细胞亚群；Th-17细胞；白介素-17

慢性肾小球肾炎(简称慢性肾炎，chronic glom-erulonephritis，CGN)以蛋白尿、血尿为主要临床表现，是我国发病率较高的一种难治性免疫介导性疾病，也是引起慢性肾衰竭最常见的原因。免疫功能紊乱在CGN发病机制中起重要作用，尤其是T淋巴细胞的免疫调节异常促使本病的发生和进展[1]。Th17细胞是近年来发现的一种新型辅助性T淋巴细胞亚群，其在肾小球肾炎发病机制中的作用逐渐受到关注。参地颗粒为我院治疗慢性肾炎的中药院内制剂，临床用于治疗脾肾亏虚型CGN近10年，具有显著降低患者蛋白尿、血尿等作用，且无明显副作用发生[2]。本研究主要观察参地颗粒对CGN脾肾气虚型患者的临床疗效及对T淋巴细胞功能紊乱的调节效应，尤其是对Th17细胞功能的影响，进一步为其临床应用提供实验依据。

1 临床资料

1.1 诊断标准

西医诊断标准参照文献制定的慢性肾小球肾炎(CGN)诊断标准[3]。中医辨证分型标准参照中华中医药学会肾病分会2006年制定的标准[4]。脾肾亏虚证：腰脊酸痛，乏力疲倦，面浮肢肿，纳少或腹胀，少气懒言，夜尿频数，大便溏薄，舌质淡红边有齿印，苔薄白，脉细。

1.2 纳入标准

符合慢性原发性肾小球肾炎诊断标准者；年龄18～60岁；中医辨证属脾肾亏虚证者；24 h尿蛋白定量≤3.0 g/24 h；血肌酐<265 μmol/L(3.0 mg/dl)；签署知情同意书。

1.3 排除标准

经综合检查(实验室及肾脏病理)证实由狼疮性肾炎、过敏性紫癜性肾炎、乙型或丙型肝炎相关性肾炎、糖尿病肾病等继发性肾小球肾炎或肾小球病，Alport综合征、薄基膜肾病等遗传性肾小球病；血肌酐≥265 μmol/L(3.0 mg/dl)；妊娠或哺乳期妇女，合并有严重心、脑、肝和造血系统等疾病，慢性炎症疾病(如支气管哮喘、类风湿性关节炎等)、慢性消耗性疾病(恶性肿瘤、结核、甲亢等)、精神病患者；近半年使用过糖皮质激素或其他免疫抑制剂者。

1.4 病例剔除及终止试验标准

不符合纳入标准，未按规定用药、合并用药影响疗效者、检测记录不全者均应剔除；试验中出现过敏反应或严重不良反应者终止试验；对于在研究过程中出现肾功能损害加重者(血肌酐升高超过基值50%以上)应终止临床试验，并给予相应的治疗；因其他种种原因导致疗程未结束而退出试验、失访者。

1.5 一般资料

表1显示，选取2013年6月至2016年6月安徽中医药大学第一附属医院肾内科病房及门诊90例患者采用随机数字表法，根据入组顺序编号随机分为试验组和对照组各45例，2组在性别、年龄、病程、血肌酐、24 h尿蛋白定量(24 hUpro)、尿红细胞计数(Urbc)等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。另选取同期来我院体检的健康人群20例作为正常组，未服用过免疫抑制剂，其年龄(35.7±7.2岁)、性别(男性13例，女性7例)与入组病例比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 患者一般资料比较

2 方法

2.1 治疗方法

2.1.1 基础治疗 所有患者均给予基础治疗包括生活方式的干预，即低盐、低脂饮食，肾功能不全者给予优质低蛋白(0.6～0.8 g/kg·d)及低磷饮食；对症治疗包含降压(血压控制目标值为晨测血压<140/90 mmHg，若血压≥140/90 mmHg给予钙离子拮抗剂，若仍不达标再加用α受体阻滞剂、β受体阻滞剂、中枢性降压药等，不使用血管紧张素转化酶抑制剂或除缬沙坦以外的血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、利尿剂)以及调节脂质代谢、抗凝和抗血小板、维持水电解质及酸碱平衡等治疗，禁用肾毒性药物。

2.1.2 对照组 加用缬沙坦胶囊由北京诺华制药有限公司生产(批准文号120116201)80 mg/d。

2.1.3 试验组 在对照组基础上，加用参地颗粒(批号20121027)，由人参、茯苓、熟地、五味子、桑螵蛸、鸡内金、川芎等药物组成)，由我院制剂室浓缩干燥成颗粒剂(每包颗粒剂10 g，约含生药34 g)，每次1包，每日3次，温水冲服。2组患者在研究期间禁止使用影响疗效的其他药物，如糖皮质激素、雷公藤多甙片或其他免疫抑制剂，2组疗程均为12周。

2.2 观察指标及方法

分别于治疗前及治疗12周后检测以下指标：①采用免疫比浊法检测24 h尿蛋白定量(24 hUpro)，流式细胞计数法检测尿红细胞计数(Urbc)；②采用流式细胞技术检测外周血CD4+、CD8+和Th17细胞：于晨时(上午8～9点)无菌操作下取患者及正常组人群外周静脉血约10ml，放入真空肝素抗凝采血管，经Ficoll Hypaque淋巴细胞分离液离心分层，取中心层的外周血单个核细胞(PBMCs)，分别注入荧光素标记的单克隆抗体20 μL，室温孵育20 min，用PBS缓冲液洗涤2次，加入体积分数为1%的多聚甲醛0.5 ml，上流式细胞仪进行分析，每个样品收集104个细胞；③采取酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白介素-17(IL-17)；④安全性指标：检测血常规、ALT、AST、肾功能、电解质、心电图等，并记录用药期间不良反应的症状及体征。

2.3 疗效评价标准[4]

临床控制：24 h尿蛋白定量<0.2 g，且尿红细胞计数正常。显效：24 h尿蛋白定量及尿红细胞计数减少均≥50%；有效：24 h尿蛋白定量及尿红细胞计数减少均≥25%；无效：上述指标无改善或加重者。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 2组疾病疗效比较

表2显示，2组疾病疗效等级分布对照比较差异有统计学意义(Mann-WhitneyU检验，P=0.000)；试验组的疾病疗效总有效率显著高于对照组(χ2检验，P=0.030)。

表2 2组疾病疗效比较[例(%)]

注：总有效率=(临床控制+显效+有效)病例数/总病例数×100%；与对照组比较：*P<0.05

3.2 2组患者治疗前后24 hUpro、Urbc比较

表3显示，治疗前2组患者24 hUpro、URBC比较差异无统计学意义(P>0.05)。与同组治疗前比较，治疗后试验组24 hUpro、URBC均显著降低(P<0.05)；对照组仅24 hUpro降低较为显著(P<0.05)。其中试验组治疗后的24 hUpro亦显著低于同期对照组(P<0.05)。

表3 2组患者24 hUpro、Urbc比较

注：与同组治疗前比较:△P<0.05；治疗后与同期对照组比较:*P<0.05

3.3 各组血清CD4+、CD8+、Th17细胞和IL-17比较

表4显示，对照组和试验组治疗前的外周血CD4+、CD8+、Th17含量、CD4+/CD8+比值及IL-17水平与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05)，对照组和试验组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。试验组治疗12周后Th17含量及IL-17水平与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05)，而CD4+、CD4+/CD8+比值显著提升(P<0.05)；且与同期对照组治疗后比较，其CD4+/CD8+比值明显提升(P<0.05),Th17含量及IL-17水平明显下降(P<0.05)。

表4 各组血清CD4+、CD8+、Th17细胞和IL-17比较

注：治疗前与正常组比较：#P<0.05；与同组治疗前比较：△P<0.05；治疗后与同期对照组比较：*P<0.05

3.4 安全性评价

2组患者在临床观察治疗过程期间未发现血常规、肝肾功能、电解质及心电图等异常；2例患者观察期间出现轻度腹泻，考虑为药物的不良反应，对症处理后未再出现腹泻，继续入组观察。

4 讨论

免疫功能紊乱引起免疫复合物在肾单位异常沉积是CGN发病的起始因素，同时在病变的慢性进展过程中，免疫炎症介导亦发挥了重要的作用。T细胞介导的细胞免疫功能紊乱与CGN的相关性已得到证实[5]。外周血T淋巴细胞有不同亚群，CD4+代表T辅助细胞(T helper，Th)，具有辅助和诱导功能；CD8+代表T抑制细胞，具有抑制和细胞毒功能；CD4+和CD8+2个亚群间的平衡是维持机体免疫系统正常运作的主要因素。Th17细胞是近来发现的有别于Th1、Th2、Treg的新型CD4+辅助性T细胞亚群，能通过高水平分泌IL-17(IL-17A)等炎症因子介导机体的慢性炎症、自身免疫性疾病等多个重要生理或病理进程[6-7]。目前Th17细胞和IL-17在肾小球肾炎发病机理中的作用受到普遍关注[8]。

本研究发现，CGN患者T淋巴细胞功能不全主要表现为CD4+及CD4+/CD8+值降低，而CD8+值增高。CD4+下降主要反映T辅助细胞降低，提示诱导辅助B细胞产生抗体功能下降，CD4+/CD8+值是人体免疫内环境稳态的重要衡量指标，它的降低则提示免疫系统的紊乱程度[9]。CGN患者同时也出现Th17细胞功能紊乱，表现为Th17细胞比例较正常人群明显增加，其分泌的IL-17水平亦显著增加，提示Th17细胞及其产生的IL-17在CGN的发生发展过程中起重要作用，有目的地针对Th17细胞或IL-17进行治疗可能是治疗肾小球肾炎的新转机。目前认为，Th17细胞可能通过下列方式促进肾小球疾病的进展[10]：一是活化中性粒细胞；二是诱导巨噬细胞分泌IL-1β和TNF-α等炎症因子；三是直接损伤肾脏固有细胞。其分泌的IL-17能促使肾小球系膜细胞释放T细胞、巨噬细胞及中性粒细胞的趋化因子，造成肾组织的慢性炎症和免疫反应[11]。

中医学认为，CGN属于中医“慢肾风”“水肿”“尿浊”“尿血”等范畴，其病变部位主要责之于脾肾。肾为先天之本，脾为后天之本，两者相互依存、相互为用；肾虚日久，封藏失职，精气不藏反泄，无以滋养脾阳，脾虚不能运化水谷精微，统摄无权以致精微下注。CGN患者尿中丢失的蛋白为人体重要的精微物质，精微物质耗损是造成脾肾亏虚的主要原因之一，而脾肾亏虚又促进了精微物质的进一步丢失。因此CGN的基本病机是脾肾亏虚、精微下注，其基本治则为健脾益肾、固摄精微。参地颗粒由人参汤化裁而成，后者出自清·新安医学名家程林删定的《圣济总录纂要·卷十三·虚劳门》，此方以人参为君，补气摄精；茯苓、熟地黄健脾、补肾为臣；佐以五味子、鸡内金、桑螵蛸加强固摄精微之功；川芎活血化瘀、气血双调，使补而不滞，亦为佐药，诸药合用共奏健脾益肾、固摄精微之效。该方秉承了新安医学“立法重温补、着眼在肾”的学术特点，健脾益肾的同时兼顾固摄精微。前期研究发现[2]，参地颗粒能明显改善CGN脾肾亏虚证患者的临床表现，降低尿蛋白和尿红细胞计数，并降低血清白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子水平。本研究肯定了参地颗粒降低CGN脾肾亏虚证患者24 hUpro和Urbc的作用，其降低24 hUpro作用甚至优于缬沙坦胶囊，疗效亦显著优于缬沙坦胶囊。本研究进一步发现，参地颗粒可以升高CGN脾肾亏虚证患者的CD4+细胞比例和CD4+/CD8+值，并降低Th17细胞含量，减少IL-17分泌水平，提示其不仅可以恢复CGN患者机体T淋巴细胞(Th1、Th2)介导的细胞免疫功能紊乱状态，而且能调节Th17细胞功能，从而发挥对CGN的治疗作用。

T细胞亚群的平衡状态与CGN的转归和预后密切相关，调节或纠正失衡的Th1/Th2、Th17免疫细胞网络系统，在CGN治疗中有着广阔的临床应用前景。中药参地颗粒能够恢复T细胞亚群平衡，调节机体Th17细胞功能，进而改善CGN的病情，值得进一步深入研究。

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Study on the Efficacy and Immune Mechanism of Shendi Granules on the Clinical Treatment in Chronic Glomerulonephritis Patients

WEI Ling1, JIN Hua1, WANG Yi-ping1△, MAO Yan-ping1, ZHANG Lei2

(1.No.1AfficiatedHospital,AnhuiUniversityofTCM,Hefei230031,China; 2.AnhuiUniversityofTCM,Hefei230031,China)

Objective:To observe the intervention effects of Shendi Granules in Th17 cell immune function on chronic glomerulonephritis (CGN) with deficiency of spleen and kidney syndrome patients.Methods:90 cases of CGN patients were randomly divided into experimental group and control group, and each group were 45 cases, giving the basic treatment of Western Medicine. The control group was treated with Valsartan Capsules (80 mg/d) on the basis of the above treatment, the control group plus Shendi Granules on the basis of experimental group treatment. Two groups were treated for 12 weeks. 24 hours urine protein (24 hUpro), urine red blood cell count (URBC) were observed before and after treatment, and flow cytometry was used to determine the content of peripheral blood CD4+、 CD8+and Th17 cells, serum interleukin -17 (IL-17) were measured by enzyme linked immunosorbent assay.Results:The total disease effective rate was significantly higher in experimental group (84.44%) compared with that in control group. 24 hUpro, URBC were significantly reduced compared with that before treatment in experimental group, and 24 hUpro in experimental group was significantly lower than that in control group after treatment. The content of CD4+, CD8+and Th17, the ratio of CD4+and CD8+, and the level of IL-17 in peripheral blood of experimental group and control group before treatment had significant difference compared with those in normal group, while there was no significant difference between experimental group and control group; The content of Th17 and the level of IL-17 was decreased sharply, the content of CD4+and the ratio of CD4+and CD8+was increased obviously in experimental group after treatment, compared with those before treatment；Furthermore, the ratio of CD4+and CD8+, the content of Th17 and the level of IL-17 in experimental group also had significant difference compared with those in control group after treatment.Conclusion:The Chinese medicine of Shendi granules could regulate Th17 cell immune function.so as to improve the immune function of CGN defiency of spleen and kidney syndrome patients. with clinical efficacy.

Chronic Glomerulonephritis (CGN); Shendi granules; T lymphocyte subsets; Th-17 cells; Interleukin-17 (IL-17)

安徽省科技攻关项目(12010402117)-基于免疫炎症介导机制探讨清热化湿祛瘀法对慢性肾衰竭湿热证患者的干预作用

魏 玲(1980-),女，安徽郎溪人，主治医师，医学硕士，从事中西医结合治疗肾脏病的临床与研究。

△通讯作者：王亿平(1963-)，安徽合肥人，教授，主任医师，博士研究生导师，E-mail：wypwyp54@aliyun.com。

R285.6

A

1006-3250(2017)06-0821-03

2016-12-21