基于结肠黏膜ICAM-1探讨芍药汤对溃疡性结肠炎（胃肠湿热证）大鼠的作用机制*

罗敏杜英杰吴强胡响当林仁敬杨宗亮李帅军何永恒

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005；2.湖南中医药大学，湖南长沙410007）

·研究报告·

基于结肠黏膜ICAM-1探讨芍药汤对溃疡性结肠炎（胃肠湿热证）大鼠的作用机制*

罗敏1△杜英杰2吴强2胡响当1林仁敬1杨宗亮1李帅军1何永恒1

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005；2.湖南中医药大学，湖南长沙410007）

目的采用RT-PCR和Western-blot检测细胞间黏附分子-1（ICAM-1）基因生成以及蛋白的表达水平，探讨芍药汤治疗溃疡性结肠炎（UC）可能的作用机制。方法随机将48只清洁级SD大鼠分为4组，分别为空白组、模型组、西药对照组（SASP组）以及芍药汤组，每组12只；模型组、芍药汤组及SASP组3组大鼠在成功制成胃肠湿热证模型基础上，再建立UC模型；造模完成后，各组大鼠分别进行疾病活动指数（DAI）评分，灌胃治疗2周，处死大鼠前对其进行第2次DAI评分，完毕后麻醉并处死各组大鼠；解剖后，取病变的结肠组织观察，进行组织大体形态损伤（CMDI）评分；随后，将病变最明显结肠组织肠段2 cm左右，平均分为两等分，分别用于检测ICAM-1基因的蛋白的表达。结果相比空白组，模型组大鼠的DAI及CMDI评分升高明显（P＜0.01），治疗后芍药汤组上述积分与模型组相比而言，下降明显（P＜0.05）；在结肠组织ICAM-1蛋白表达方面，Western-blot结果显示，模型组大鼠灰度值较空白组明显下降，治疗后，芍药汤组与SASP组ICAM-1灰度值均有所上升，且与正常组水平相近；大鼠结肠组织中ICAM-1 mRNA生成方面，与空白组相比而言，模型组上升明显（P＜0.01），而在治疗后与模型组相比，芍药汤组及SASP组ICAM-1 mRNA生成水平显著降低（P＜0.01）。结论芍药汤通过抑制UC（胃肠湿热证）大鼠结肠黏膜组织中ICAM-1基因及蛋白的表达，从而改善UC大鼠的症状及体征，这可能是其治疗UC的作用机制。

芍药汤溃疡性结肠炎细胞间黏附分子-1

炎症性肠病（IBD）是对小肠及结肠所处的慢性、自发的炎症状态的概括，然而其病机尚未明确，目前多认为其为肠道菌群、肠粘膜免疫反应、环境因素及基因组成等方面的复杂相互作用所导致［1］。目前临床医学认为，IBD主要包括两种疾病，分别为溃疡性结肠炎（UC）以及克罗恩病（CD），与CD不同的是，UC病灶多局限于大肠黏膜及黏膜下层［2］。免疫因素在UC发病中扮演的角色至关重要。正常情况下，体内的抗炎因子以及促炎因子是相对平衡的，这个平衡在一个正常范围内波动，当其波动超出正常范围时，两者失去平衡，导致UC发病［3］。黏附分子（AMS）家族为一类受体型糖蛋白，一般通过诱导淋巴细胞归巢和刺激细胞分化参与调节免疫系统功能，其作用与UC发病之间的关系越来越受到重视。ICAM-1是黏附分子家族中的一员，其在目前的研究中较受重视，有研究发现，处于活动期UC患者的外周血中，ICAM-1表达显著增高，在肠组织中表达亦较明显，且其表达水平的高低同病情的轻重呈正相关［4］。柳氮磺胺吡啶、激素及免疫抑制剂等是治疗UC的常用药物。近年来，靶向药物如英弗利希也投入使用，但目前UC的治疗效果尚待优化。中医药在其中可充分发挥其价格低廉、双向调节剂毒副作用低等优势。芍药汤是中医临床上用来治疗UC（胃肠湿热证）的常用方之一。本实验从结肠黏膜组织中ICAM-1出发，探讨芍药汤治疗UC（胃肠湿热证）大鼠的可能作用机理。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD大鼠48只，雄性，体质量180～200 g，由斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（湘）2013-0004。使用许可证号：SYXK（湘）2013-0005。所有大鼠进入实验室后，控制实验室温度、适度以及良好通风等，适应性饲养1周。

1.2 试药与仪器造模剂2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS），美国Sigma公司；TRIzol试剂、琼脂，Invitrogen公司；反转录试剂盒、PCR试剂盒，Promega Corporation公司。一抗ICAM-1、SP免疫组化染色试剂盒、DAB染色试剂盒，北京博奥森生物工程开发有限公司。核酸水平电泳仪；实时定量PCR仪；离心机（Centrifuge 5424 R德国Eppendorf公司）；凝胶成像系统；高速低温离心机；核酸蛋白浓度测定仪；电泳仪BIORAD；酶标仪；干式恒温器（K30杭州爽盛仪器）微量移液枪（各种型号，美国Rainin PiPet-Lite）；全自动化学发光分析仪（Tanon-5200上海，天能）。阳性药物柳氮磺胺吡啶（SASP）（批号H31020557，剂量0.25/片）。芍药汤方中各中药饮片均由湖南中医药大学附属二院药房提供，按每毫升药液含生药1.2 g的浓度煎制而成。

1.3 造模与分组动物分组，将48只雄性SD大鼠按完全随机法平均分成4组，分别为空白组、模型组、SASP组及芍药汤组。除空白组外，另外3组大鼠均参照文献［5］制成胃肠湿热模型。胃肠湿热模型成功建立后，采用三硝基苯磺酸（TNBS）以及40％乙醇按照1∶1的质量比灌肠，建立UC大鼠模型［6］。造模后各组大鼠常规喂养。4 d后，各组大鼠中随机选取1只处死，取大肠沿长轴方向剪开，平铺进行观察距离肛缘6～10 cm处是否出现溃疡面，并通过病理检查证实此区域改变为炎性改变，同时空白组大鼠在该部分结肠黏膜未见上述改变，即可确定造模成功。各组于确定造模后第2日开始，芍药汤组根据体重质量比按含生药量9.2 g/kg灌胃给药，SASP组根据体重质量比按含生药量0.3 g/kg灌胃给药，上述中西药均由蒸馏水配制成溶液，然后将配制好的药液按照10 mL/kg体积比灌胃，空白组、模型组大鼠亦按照10 mL/kg体积比给予0.9％氯化钠溶液灌胃。连续给药14 d，每日1次。

1.4 观察指标实验完成后，按照0.4 mL/100 g的比例以质量分数为10％的水合氯醛行腹腔麻醉，麻醉见效后，解剖大鼠，取下病变明显处结肠组织2 cm，大致均分为两部分，分别用于检测结肠黏膜组织ICAM-1的基因及蛋白的表达水平。观察指标包括1）确定造模成功后首次灌胃给药前以及处死麻醉前对各组大鼠进行炎症活动指数（DAI）评分［7］；2）对大鼠病变结肠进行组织大体形态损伤（CMDI）评分［8］；3）Western-blot法检测大鼠结肠黏膜组织ICAM-1蛋白表达水平：将组织剪成细小的碎片，按照比例加入需要浓度的裂解液，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解完成后，取适量样品在温度为4℃，离心机转速为12000 g的条件下进项持续离心15 min，其后取上层清亮液，进行蛋白质定量检测，随后将其贮存于冰箱中，贮存温度为-80℃。上述提取的蛋白经电泳转膜后，脱脂奶粉封闭，ICAM-1抗体随后添入封闭液中，并将其稀释到目标浓度，在4℃的条件下孵育12 h，再与HRP标记的二抗进行反应。最终ECL化学发光检测。然后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，显示的带扫描后在凝胶影像分析仪上分析条带。4）RT-PCR法检测大鼠结肠黏膜组织ICAM-1基因生成水平：Trizol法提取RNA后，对采用RT-PCR法ICAM-1 mRNA进行检测，上游引物序列5′-GCAGGTGAACTGCTCTTCCT-3′，下游引物序列5′-GTCTTCCCCAATGTCGCTCA-3′，扩增长度130 bp；内参β-actin，上游引物序列5′-ACAACCTTCTTGCAG CTCCTC-3′，下游引物序列5′-CTGACCCATACCCACCATCAC-3′，长度200 bp；采用2-△△Ct法处理结果，并进行统计比较。

1.5 统计学处理应用SPSS19.0统计软件。计量资料数据以（±s）表示，组间两两比较若方差齐时选择配对t检验，方差不齐时选择符号秩和检验，相关性分析采用线性回归。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

最终疗程结束前，模型组大鼠死亡2只，芍药汤组大鼠死亡1只，最终各组大鼠数目分别为空白组11只、模型组9只、SASP组11只、芍药汤组10只。

2.1 DAI评分及CMDI评分结果见表1。给药前经造模处理的各组大鼠DAI评分显著高于空白组（P＜0.01），治疗后与模型组和本组治疗前比较均显著下调（P＜0.05）。CMDI评分在治疗后SASP组与芍药汤组大鼠较模型组显著下调（P＜0.05）。

表1 各组大鼠DAI评分及CMDI评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠DAI评分及CMDI评分比较（分，±s）

与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与本组治疗前比较，△P＜0.05。下同。

DAI评分治疗前治疗后空白组110.24±0.170.27±0.190.49±0.38组别nCMDI评分模型组93.72±0.91*SASP组102.38±0.85*#3.44±0.49*3.38±0.41*3.39±0.52*2.23±0.39*#△芍药汤组112.14±0.57*#3.24±0.43*2.17±0.42*#△

2.2 各组大鼠结肠黏膜组织中ICAM-1蛋白水平比较见表2。各治疗组大鼠经治疗后，与模型组大鼠比较均显著上调（P＜0.01）。

表2 各组大鼠结肠黏膜组织中ICAM-1蛋白灰度值比较（±s）

表2 各组大鼠结肠黏膜组织中ICAM-1蛋白灰度值比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

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2.3 各组大鼠结肠黏膜组织中ICAM-1 mRNA水平比较见表3。各治疗组大鼠经治疗后，与模型组大鼠比较ICAM-1 mRNA水平均显著下调（P＜0.01）。

3 讨论

目前UC是世界卫生组织认可的难治病之一［9-10］。ICAM-1作为黏附分子免疫球蛋白超家族中较为重要的一员，在机体处于稳定以及平衡条件下，ICAM-1表达水平很低，甚至不表达，只有机体在受到内毒素或者炎性细胞因子刺激后，其可在多种细胞中表达。当细胞过度表达ICAM-1时，血管内皮细胞之间的紧密连接程度较前降低，相互之间的间隙增宽，导致血管壁通透性增加，与此同时大量白细胞向血管边缘聚集黏附，这使得炎症细胞大量从血管中向周围组织渗出，当其到达炎症部位时，白细胞释放许多的介导炎症的细胞因子等，而其他炎症因子的过度增高亦会刺激ICAM-1的表达，两者之间形成一个恶性循环，当缺乏外部条件干扰时，其会使炎症反应加重恶化［11］。研究发现，ICAM-1在介导炎症细胞如中性粒细胞募集和趋化的过程中作用是十分重要的。在UC患者疾病处于活动期时，其外周血中ICAM-1的生成表达水平上升明显，其在结肠黏膜组织中表达也会相应增高，且其表达水平的高低同病情的轻重呈正相关［4］。SASP是磺胺类抗菌药物中的一种。其口服不易被吸收，在肠微生物作用下，其被分解成5-氨基水杨酸（5-ASA）和磺胺吡啶［12］。5-ASA是该药的发挥药理作用的主要成分，其与肠壁结缔组织稳定结合并长期停留，发挥其抑制免疫功能的作用，如有效抑制前列腺素以及其他炎症介质如白三烯的生成水平，而磺胺吡啶则发挥其抗菌消炎的功效，抑制大肠杆菌以及梭状芽胞杆菌，从两个方面起到治疗UC的作用。

表3 各组大鼠结肠黏膜组织ICAM-1mRNA相对表达量比较（2-△△CT，±s）

表3 各组大鼠结肠黏膜组织ICAM-1mRNA相对表达量比较（2-△△CT，±s）

组别n ICAM-1 mRNA相对表达量空白组11模型组9 SASP组10 0.61±0.26 7.50±0.81*1.74±0.31*##芍药汤组111.83±0.27*##

UC属于中医学“休息痢”范畴。临床中对于UC（胃肠湿热证），我们常使用经方芍药汤，疗效可观。芍药汤功擅清热燥湿、调和气血，方中黄芩、黄连清热燥湿，直指病因之湿热，二药共为君药；芍药养血和营、柔肝敛阴，当归养血活血，二药体显“行血则便脓自愈”之义，且肝为血海，脾主运化，二药可使肝之疏泄功能得以正常发挥，肝脏疏泄正常，不犯脾土，则气血调和，木香行气宽中，槟榔行气导滞，二药合用发挥调气作用治疗后重之症状。因此上四味共为臣药；大黄佐助，肉桂佐制；甘草健脾和中，调和诸药，又可配芍药以缓里急、止腹痛，为佐使；诸药合参，使湿热驱之有道，气血条畅通达，从而使得下痢、便脓、腹痛诸症由此得愈［13-16］。

本实验研究发现，芍药汤对大鼠结肠黏膜组织中ICAM-1基因及蛋白的表达具有负向调节作用，同时其可明显地改善UC（胃肠湿热证）大鼠症状及体征。故本研究认为芍药汤治疗UC（胃肠湿热证）可能是通过抑制大鼠结肠黏膜组织中ICAM-1基因及蛋白的表达来实现的。

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Discussion of the Mechanism of Peony Decoction on Gastrointestinal-syndrome Rats with Ulcerative Colitis Based on Colonic Mucosa ICAM-1

LUO Min，DU Yingjie，WU Qiang，et al.The Second Hospital Affili-ated to Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410005，China.

Objective：To study the feasible mechanism of Peony Decoction on ulcerative colitis by detecting the expression level of gene and protein of Intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）through RT-PCR and Western-blot.Methods：48 clean grade SD rats were randomly divided into the blank group，the model group，Peony Decoction group and SASP group，12 rats in each.Rats in the model group，Peony Decoction group and SASP group were built with Gastrointestinal syndrome，and based on it，they were made into ulcerative colitis model.All rats were marked on DAI after modeling，and after 14 days′lavage treatment，they were marked on DAI for the second time.Then they were narcotized and killed，abnormal tissues with pathological changes were chosen to make CMDI scores；2 cm of each tissue was chosen to detect the expression level of gene and protein of ICAM-1. Results：Compared with the blank group，rats in the model group got a higher level in DAI and CMDI，and the difference was obvious（P＜0.01）.After treatment，DAI scores of rats in Peony Decoction group was lower than those in the model group（P＜0.05）.In the expression of protein of colonic mucosa ICAM-1，grey level of rats in the model group was significantly lower than that in the blank group.After treatment，it rose in SASP group and Peony Decoction group，close to that of the blank group.The expression of mRNA of colonic mucosa ICAM-1 in the model group was significantly higher than those in the blank group（P＜0.01），and after treatment it dropped in SASP group and Peony Decoction group（P＜0.01）.Conclusion：Peony Decoction can obviously suppress theexpression level of mRNA and protein of colonic mucosa ICAM-1，which may be the feasible mechanism of Peony Decoction on Ulcerative colitis.

Peony Decoction；Ulcerative colitis；ICAM-1

R285.5

A

1004-745X（2017）06-0959-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.006

2017-03-29）

湖南省中医药科研计划项目科研基金课题（2015142）；湖南省教育厅科学研究项目（20171652）；湖南省教育厅重点学科中医外科学开放基金课题（湘教发［2011］76号）

△通信作者（电子邮箱：min3813493@163.com）