岭南牛mtDNA D-loop区遗传多样性研究

赵晓诚，党瑞华，黄永震，蓝贤勇，宋恩亮，陈 宏，左自意,雷初朝﹡

(1．西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东 济南 250100;3.陕西意发生态农牧发展有限公司,陕西 山阳 726499)



科学试验

岭南牛mtDNA D-loop区遗传多样性研究

赵晓诚1，党瑞华1，黄永震1，蓝贤勇1，宋恩亮2，陈 宏1，左自意3,雷初朝1﹡

(1．西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东 济南 250100;3.陕西意发生态农牧发展有限公司,陕西 山阳 726499)

[目的] 通过测定岭南牛线粒体D-loop全序列来了解岭南牛的母系起源及遗传多样性。[方法] 采用PCR扩增、测序及生物信息学方法。[结果] 通过对30头岭南牛mtDNA D-loop序列分析，共发现62个变异位点和19种单倍型，核苷酸多样度(Pi)为0.0260，单倍型多样度(Hd)为0.8920，表明岭南牛遗传多样性丰富。构建的NJ系统进化树表明岭南牛有普通牛和瘤牛2种母系起源。[结论] 岭南牛属于南方牛类型，受瘤牛的影响较大，具有瘤牛和普通牛的种质特征。

岭南牛；mtDNA D-loop；遗传多样性；母系起源

我国黄牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛的统称。中国是世界上黄牛品种资源最丰富的国家之一。按地域将中国黄牛分为北方黄牛、中原黄牛和南方黄牛三种类型[1]。关于中国黄牛的起源，历来有不同的观点。国内学者在我国黄牛Y染色体分子遗传多态性[2,3]、血液蛋白多态性[4]及线粒体DNA限制性片段长度多态性(mtDNA RFLP)[5]等多个层面做了大量研究，结果均支持我国黄牛为多元起源的观点。北方黄牛大多属于普通牛，而瘤牛主要影响南方黄牛，中原黄牛同时受普通牛和瘤牛的影响。

线粒体是动物细胞中重要的细胞器之一，也是一种遗传信息载体。哺乳动物的线粒体DNA (mtDNA)位于细胞质中，是一种共价闭合的环状双链DNA分子，其大小约为16. 5 kb。线粒体DNA的基因组织结构简单、稳定，在世代间没有基因重组，但其进化速率却比单拷贝核基因高5～10倍。线粒体DNA的遗传过程严格遵守单性母性遗传，即仅从卵子的细胞质中遗传到下一代，不受国外引进公牛的影响，可以更好地反映家牛的母系起源[6-8]。而在mtDNA中，D-loop区的进化速率又比其他区域高出5～10倍，是线粒体DNA中研究最多的标记。雷初朝等[9]首次对我国8个黄牛品种的mtDNA D-loop 区全序列进行了测序分析，发现中国黄牛主要为普通牛和瘤牛起源。Loftus 等[10]测定了6 个欧洲牛、3个印度牛、4 个非洲牛品种的D-loop 序列，发现家牛D-loop序列明显分为瘤牛和普通牛两种支系。

近年来，国内在黄牛线粒体D-loop 区方面做了大量的研究，但关于岭南牛的遗传多样性研究还未见报道。岭南牛主产于陕西省商洛市秦巴山区的山阳、镇安、柞水等县。1982年邱怀教授等专家赴产区进行考察，将其命名为岭南牛。岭南牛具有适应性强、挽力大、耐粗放、善爬坡、产肉性能好、繁殖力高等优良品质[11]。本研究主要通过测定岭南牛线粒体D-loop全序列，以鉴定其母系起源及遗传多样度，为其保种和改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

在陕西省商洛市山阳县牛耳川镇意发牛场采集30头岭南牛耳组织样，用75%酒精保存，并存放至-20℃冰箱备用。

1.2 基因组DNA提取及PCR扩增与测序

采用酚-氯仿法提取基因组DNA。采用雷初朝等[9]设计的引物扩增线粒体DNA D-loop全序列，正链引物和反链引物分别为：F：5′-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′; R：5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。PCR反应体系总体积为20 μL，扩增程序为：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸90 s，共40个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物采用1.0%的琼脂糖凝胶检测其大小、纯度及亮度，将检测合格的PCR产物送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。

1.3 数据处理

利用DNASTAR程序包中的SeqMan程序对30条岭南牛D-loop序列及从GenBank 引用的2 条非洲牛支系(L27733 , L27735 )进行人工校正与序列比对。用DNASP 5.0统计核苷酸多态位点、单倍型数量、单倍型多样度、核苷酸多样度、平均核苷酸差异等。用MEGA7软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 岭南牛mtDNA D-loop区核苷酸变异与单倍型多样性

30头岭南牛mtDNA D - loop区全序列中，12头黄牛D-loop区长910 bp，17头长911 bp，仅有1头长度为912 bp，这些都是因为D-loop区存在碱基插入与缺失。在30头岭南牛线粒体D - loop中共发现变异位点62个，占核苷酸总数的6.81%；其中，4种碱基A、T 、C、G 的频率分别为33%、28.4%、25.0%、13.6%，平均核苷酸差异K为23.6390，核苷酸多样度(Pi)为0.0260。在62个多态位点中，转换59个(占95.2%)，其中35个C/T转换，24个A/G转换；颠换3个(占4.8%)，均为C/G颠换。利用DNASP 5.0分析比较，发现30头岭南牛mtDNA D-loop序列有19种单倍型，单倍型多样度(Hd)为0.8920；其中13种为普通牛单倍型，有14个个体；6种为瘤牛单倍型，有16个个体。

图1 岭南黄牛19个mtDNA D-loop单倍型及其多态位点

图2 岭南牛19个mtDNA D-loop单倍型构建的NJ系统树

参考Loftus等[10]发表的瘤牛序列(No. L27733)定义变异类型。“.”代表与第一条序列相同。

2.2 岭南牛的系统进化树

根据测序的30条岭南牛mtDNA D-loop序列，定义了19种单倍型，从GeneBank 上下载普通黄牛序列L27735，瘤牛序列L27733作为对照，利用MEGA7.0软件对岭南牛19个单倍型构建NJ进化树。从图2中可以看出，该进化树共分为两个支系，一支为瘤牛，一支为普通牛，说明岭南牛是普通牛和瘤牛的混合母系起源。

3 讨论

近年来，D-loop区序列的核苷酸变异分析是动物mtDNA研究最常用的标记，国内也做了很多相关研究，但是有关岭南牛D-loop区遗传变异的研究尚未见报道。本研究所检测的30头岭南牛D-oop序列，有12头序列长度为910 bp，17头长911 bp，仅有1头长度为912 bp。这是由于mtDNA D-oop序列在762～769 bp之间为连续的碱基C，非常容易发生序列长度的变异[12-14]。

核苷酸多样度(Pi)是衡量群体遗传变异程度的重要指标。核苷酸多样度(Pi)越高，则表明群体间遗传变异越大。雷初朝等[9]分析中国8个黄牛品种mtDNA D-loop区序列，发现其Pi值为0.0055～0.0539；蔡欣[13]发现中国17个黄牛品种的平均Pi值为0.0268。本研究发现岭南牛的Pi值为0.0260，与蔡欣的结果基本一致，说明岭南牛的遗传多样性比较丰富。本研究发现岭南牛的单倍型多样度(Hd)为0.8920，仅比蔡欣[13]研究的中国17个黄牛品种的平均单倍型多样度(0.9190)略低，表明岭南牛群体遗传变异程度相对较高，遗传多样性丰富，这可能与岭南牛处于山区，与外界交流较少有关。本研究发现岭南牛19种单倍型中，有13种单倍型为普通牛，个体数为14头；6种单倍型为瘤牛血统，个体数为16头，表明岭南牛受瘤牛影响更大一些，这与周艳等[14]对中国部分南方黄牛mtDNA D-loop区的研究发现南方黄牛受瘤牛的影响更大的结论一致。

总之，本研究发现岭南牛mtDNA遗传多样性比较丰富，具有普通牛和瘤牛两大母系起源，在遗传血统上更偏向于瘤牛，且具有普通牛与瘤牛的种质特征。

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Genetic Diversity of mtDNA D-loop Region in Lingnan Cattle

ZHAO Xiao-cheng1, DANG Rui-hua1, HUANG Yong-zhen1, LAN Xian-yong1, SONG En-liang2, CHEN Hong1, ZUO Zhi-yI3,LEI Chu-zhao1*
(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan,Shandong, 250100,China;3.ShaanxiYifaEcologicalAnimalHusbandryDevelopingco.ltd,ShaanxiShanyang726499)

[Objective] The aim of the research was to study the maternal origin and genetic diversity of Lingnan cattle. [Method] The complete mtDNA D-loop regions of 30 Lingnan cattle were analyzed using PCR, sequencing and bioinformatics methods. [Result] The results showed that 62 variations were detected in the complete mtDNA D-loop regions of 30 Lingnan cattle, which defined 17 haplotypes. The nucleotide diversity (Pi) was 0.0260, and the haplotype diversity (Hd) was 0.8920, indicating an abundant genetic diversity in Lingnan cattle. The neighbor-joining tree showed that Lingnan cattle had two types of maternal origins from Bos taurus and Bos indicus. [Conclusion] Lingnan cattle, belonging to the southern cattle type in China, which was mainly affected by Bos indicus, had two types of maternal origins from Bos taurus and Bos indicus.

Lingnan cattle；mitochondrial DNA D-loop；genetic diversity；maternal origin

2017-02-12 接收日期:2017-02-20

国家肉牛牦牛产业技术体系资助(CARS-38)。

作者简介：赵晓诚(1992-)，男，山西永济人，硕士生，主要从事动物遗传资源研究。

*通讯作者：雷初朝(1968-)，男，湖南常宁人，教授，博导，主要从事牛遗传资源研究。

S823.2

A

1001-9111(2017)02-0001-03