影响大额牛精液质量主要因素的研究

毛翔光，赵家才，杨彩云, 高玉琼, 何永富，李 雯,张 洁

(云南省种畜繁育推广中心，云南 昆明 650212)



影响大额牛精液质量主要因素的研究

毛翔光，赵家才，杨彩云, 高玉琼, 何永富，李 雯,张 洁

(云南省种畜繁育推广中心，云南 昆明 650212)

[目的]大额牛为我国地方畜禽遗传资源濒危品种，为了加强大额牛的保种力度，提高保种效率；本研究对影响大额牛精液质量的主要因素如采精方法、季节、个体遗传等进行了比较研究。[方法] 大额牛用电刺激法和假阴道法采精，按照牛冷冻精液国家标准GB4143-2008的方法测定大额牛的采精量，精子密度，原精活力和冷冻精液解冻活力, 用程控冷冻仪冷冻大额牛精液。[结果]大额牛冷冻精液解冻效果较好，采精量为5.009±2.239 m}(n=226)，原精活力为54.184±15.760%(n=223)，精子密度为7.207±6.387亿/mL(n=225)，解冻活力为36.007±2.092%(n=136)。精子冷冻解冻复苏率达50%以上。大额牛电刺激采精成功率高。[结论]迁地保护条件下大额牛电刺激法采精获得很好效果，也能用假阴道法采精,精液冷冻解冻效果较好，有利于大额牛遗传物质的保存。

大额牛；迁地保种；冷冻精液；濒危；解冻；遗传资源

大额牛在我国仅产于云南省贡山县独龙江一带，是一种珍贵的畜类，其分类学地位属于牛亚科黄牛属(BOS)中独立的一个种Bos Frontalis。大额牛成年体重：公牛平均400～500 kg、母牛平均350～400 kg，12月龄平均体重可达200 kg；大额牛性成熟较晚，在自然野生状态下，一般约50月龄才能达到性成熟；染色体数目2n=58。贡山县为独龙族怒族聚居区，大额牛在当地主要供肉食用，在野牧条件下具有良好的产肉性能，肉质优良，是我国的一个珍稀牛种。大额牛产区由于地处我国西南边陲的少数民族地区，自然条件恶劣，地理环境非常特殊，交通极其不便，大额牛的驯养还处于较原始的状态，目前尚处于半野生半家养状态[1]。因此，我们开展了大额牛的迁地保种,进行了大额牛微型细管冷冻精液的试验研究，对影响大额牛精液质量的因素进行了分析研究。

1 材料和方法

1.1 大额牛牛的饲养管理

大额牛从其原产地怒江州贡山县引进到云南省种畜繁育推广中心冷冻精液站,饲养方式为人工舍饲，日粮为全混合饲料，夏秋补饲适量青饲料，供给清洁饮水,定期免疫和检疫。

1.2 试验牛精液的来源

供试大额牛精液来源于迁地保护依法引进的纯种大额牛。经过简单驯化调教后，用电刺激法和假阴道法采集大额牛精液进行冷冻精液制作。

1.3 大额牛的电刺激法采精[2]

把采精的大额牛由饲养员牵引到保定架内妥善保定，确保人、畜安全。采精前用0.05%～0.1%的高锰酸钾溶液清洗大额牛包皮和外阴部，采精员和精液收集员站在大额牛的左、右侧并由另一助理将电刺激采精器电极探头插入采精公牛直肠，然后打开电源输出按钮，使用自动或手动脉冲刺激大额牛副性腺使其充分分泌和阴茎勃起，待大额牛副性腺分泌和阴茎勃起充分后，当开始排精时收集其精液。

1.4 大额牛的精液品质测定指标

大额牛采精后，分别测定其采精量，精子密度，精子活力和畸形率，精子畸形率用姬姆萨染色法染色后镜检，合格的鲜精用于制作冷冻精液。

1.5 大额牛冷冻精液的制作程序

大额牛精液的采集。采集大额牛的精液要注意保温防尘，防辐射。大额牛精液品质检验：按照国家牛精液品质检验方法，测定大额牛的采精量、精子密度、精子活力等指标[3]。

大额牛精液的稀释。经检验，原精活力达60%以上，鲜精密度达3.0亿/mL以上，且无其他异常的原精在等温下用备好的冷冻稀释液进行稀释[3]，每个剂量塑料细管中精子总数为2 000～2 300万。

大额牛精液的平衡与分装标记。稀释后的大额牛精液在室温下分装分装于塑料细管中，自动封口和打印标记信息，待精液温度降至室温时(约1～1.5 h)，然后置于+4℃的冰箱或低温操作柜中降温平衡2～4 h，然后在温度为4℃下把大额牛细管精液整齐排放在冷冻架上，把需要冷冻的全部精液放入程控冷冻仪内进行冷冻，冷冻曲线为：精液从+4℃以5℃/min的速度降温至-10℃，再由-10℃以40℃/min的速度降温至-100℃，从-100℃以20℃/min的速度降温至-140℃后取出冷冻后的全部精液放入液氮中，包装与拇指管内，随机抽样解冻，检查冷冻解冻后精子活力等指标，常规解冻精液的水浴温度为37±2℃，显微镜载物台温度为37℃[4]，冻精解冻时间10 s，解冻活力达0.35以上者储存备用。

1.6 数据来源和处理[4]

大额牛精液质量测定数据来源于1998年至2002年和2011年至2016年的采精记录,用生物统计法进行统计分析和显著性检验。

2 结果

大额牛用电刺激法采精，采精量为5.24±2.372 mL(n=148)，原精活力为56.36±14.314%(n=148)，精子密度为4.43±4.585亿/mL(n=148)，解冻活力为35.95±1.975%(n=84)。大额牛采精成功率为98.67%(223/226)，电刺激采精可利用率为56.76%(84/148)；假阴道法采精采精量为4.38±1.645 (n=66)，原精活力为55.41±9.757(n=66)，精子密度为14.07±5.0635亿/mL(n=66)，解冻活力为36.10±2.286%(n=52)，假阴道采精可利用率78.79%(52/66)。电刺激法采精和假阴道法采精可利用率差异极显著(Uc=2.94>2.58,P<0.01),大额牛精液质量和方差分析结果见表1、表2、表3、表4、表5和表6。

2.1 不同个体大额牛精液质量

迁地引进的大额牛进行了采精，不同个体大额牛精液质量见表1。

2.2 不同年度大额牛精液品质

TL001连续五年采精，1998至2002年度精液质量见表2。

表1 不同大额牛个体精液品质比较

注：表1同一纵列数据中右上角标有不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，右上角标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，右上角标有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)；以下表2-6数据右上标字母与表1标示相同。

表2 TL001不同年度大额牛精液品质比较表

2.3 不同季节大额牛精液品质

不同季节大额牛精液质量见表3。

2.4 第一次采精和第二次采精大额牛精液质量

223号大额牛电刺激采精后，间隔40 min，再进行第二次电刺激采精，第一次和第二次电刺激采精精液质量见表4，第一次采精报废率45.098%(23/51)极显著高于第二次采精报废率11.765%(6/51)(Uc=3.51>2.58，P<0.01)，详见表4。

2.5 电刺激法采精和假阴道法采精大额牛精液质量

TL001先用电刺激法采精,经过诱导调教,能用假阴道法采精,详见表5。

2.6 大额牛与云岭牛、西门塔尔牛电刺激法采精精液质量

大额牛与其它品种牛电刺激法采精，精液质量见表6。

表3 不同季节大额牛精液品质比较表

表4 第一次采精和第二次采精大额牛精液质量比较表

表5 不同采精方法大额牛精液质量

表6 大额牛与云岭牛、西门塔尔牛电刺激采精精液品质比较表 =

3 讨论

3.1 大额牛迁地人工饲养条件下采精效果良好

大额牛用电刺激法进行采精，采精成功率高，利于收集精液，是一种行之有效的采精方法。大额牛精液的冷冻解冻效果较好，采精成功率较高，WL002公牛精液报废率较高达100%，不能用于制作冷冻精液,主要原因是原精活力低，精子畸形率高，达不到生产冷冻精液的标准。

3.2 大额牛精液冷冻效果良好，制作流程合理

稀释后的大额牛精液在室温下分装，精液分装入塑料细管后增加了表面积，有利于精液均匀快速地降温。大额牛精液鲜精活力达60%以上，鲜精密度达3.0亿/mL以上，每个剂量塑料细管中精子总数为2 300万左右，分装后的大额牛精液置于+4℃的冰箱中降温平衡3～4 h，平衡后的大额牛细管精液整齐排放在细管冷冻架上全部放入程控冷冻仪内由+4℃以5℃/min的速度降温至-10℃，再由-10℃以40℃/min的速度降温至-100℃，从-100℃以20℃/min的速度降温至-140℃后取出冻精放入液氮中包装，同时随机抽样解冻，检查冷冻后精子活力等指标，解冻活力可达到35%以上，有效精子数达800万个以上，符合国家牛冷冻精液标准的要求。大额牛冷冻精液人工授精受胎率与其它肉牛品种相近，后代长势良好。大额牛冷冻精液解冻后立即输精或解冻后1 h之内输精，输精效果并不会明显下降，建议在使用冷冻精液输精时，最好解冻后立即输精，若不能及时输精，解冻后精液的保存时间不要超过2 h为宜。

3.3 影响大额牛精液质量的主要因素

遗传、饲养管理、季节、年龄、制作流程、个体、疾病、检疫、免疫、冷冻稀释液和生活环境等因素均能影响大额牛精液质量。科学的制作流程(特别是稀释液)为影响大额牛精液冷冻效果的关键：大额牛精液平衡时间2～4 h，大口罐内冷冻6 min，程控仪冷冻7～8 min，即可获得较好的冷冻解冻效果，精液冷冻时，由于精液温度较高(+4℃)冷冻降温时放热，程控仪内液氮蒸气温吸热，精液放出的热量dis的阈值与精液的变态吸收热量熵流des的绝对值相等符号相反[5～6]，程控仪内温度下降曲线反弹升高达峰值，然后降温曲线继续下降，温度降至-140℃以下时达到保存冷冻精液的安全温度。精子在冷冻过程中由于过冷却、冷休克、降温过程的危险温区，冷冻速度，冰晶的形成等因素对精子的危害在实际生产中难以完全克服，在冷冻精液解冻过程中也无法避免和克服温度回升过程中危险温度对精子的危害；不同大额牛个体的精液质量受遗传、季节、年龄、饲养管理等因素的影响[7]，同时，还受生存环境、驯化程度、采精制度和方法等因素的影响，个体间精液质量差异明显，WL002精子活力极差，畸形率高，TL001精子密度较高，但采精量却较低；精液活力和采精量夏、秋季优于冬春季；同一采精日，第二次电刺激采精效果好于第一次电刺激采精，原精活力和密度极显著提高(P<0.01)；假阴道法采精精子密度极显著高于电刺激法采精(P<0.01)，精子活力差异不明显(P>0.05)大额牛电刺激法采精量和精子密度均极显著低于西门塔尔牛和云岭牛电刺激法采精量和精子密度，西门塔尔牛电刺激法采精量明显增加，但精子密度较低，不同的采精操作人员熟练也会造成采精效果存在差别。本研究未考虑饲养管理、疾病、检疫、免疫、生活环境等因素对大额牛的影响，今后有必要进行深入的探讨。

总之，从目前的研究结果看，大额牛冷冻精液解冻活力较好，精子复苏率比较高，受胎率比较理想，采精方法和采精技术已经成熟，冷冻精液制作工艺流程合理。大额牛为濒危珍稀牛种，科学研究和保种工作刻不容缓，仍需不懈努力，继续进行深入的实验研究，提高大额牛保种的时效性和科学性。

[1] 赵家才，何华川，张翠兰.大额牛冷冻精液技术的研究[J]. 黄牛杂志，2005,31(4):16-18.

[2] 赵家才，刘国璋.三种采精方法在种公牛上的应用效果分析[J]. 黄牛杂志，2001,27(1)：48-50.

[3] 刘海良.种公牛培育技术手册,.41-49.-[4] 明道绪.生物统计附试验设计 [M]. 北京：中国农业出版社，2004.78-80,84-87,92-108.

[5] 赵来珍，刘发理.牛冷冻精液精子复苏规律及其机理[J] 黄牛杂志 1994,20(增刊)37.

[6] 邓福金，吴庆荣，王化青.冷冻温度对牛精子复苏率及降温速率变化规律的研究[J].中国牛业科学，2010,36(5)：27-29.

[7] 王力波,石惠芝.影响精子产量的因素[J].中国奶牛,1999,17(1):38-39.

The Study on the Main Factors of Semen Quality of Gayal

MAO Xiang-guang, ZHAO Jia-cai, YANG Cai-yun, GAO Yu-qiong, HE Yong-fu, LI Wen, ZHANG Jie
(YunnanProvincialLivestockBreedingCenterandExtensionCenter,Kunming,Yunnan, 650212,P,R,China.)

[Objective] This study was to protect the breed conservation of Gayal, which is a local endangered species of livestock and poultry genetic resources in China. The main influencing factors of Gayal semen quality were comparatively studied in this research, such as semen collection method, season, individual genetic etc. [Methods] The Gayal semen was collected by electric stimulation method and artificial vagina method. Then the ejaculate volume, sperm density, sperm motility and semen freezing thawing activity were determination according to the national standard GB4143-2008 of bovine frozen semen. And, the semen was frozen using programmed freezing instrument. [Results] The thawing effect of Gayal frozen semen was well, and the ejaculate volume was 5.009 + 2.239ml (n=226). Sperm motility was 54.184 + 15.760% (n=223), and the sperm density was 7.207 + 6.387 million /mL (n=225). Thawing activity was 36.007 + 2.092% (n=136). The frozen semen thawing recovery rate was above 50%. Moreover, the success rate of electric stimulation of Gayal semen was high. [Conclusion] The electric stimulation semen collection method can obtain good effect in Gayal under the condition of ex-situ conservation, and the effect of semen freezing thawing is good, which is beneficial for the preservation of genetic material.

Gayal; ex-situ conservation; frozen semen; endangered; thawing; genetic resources

2016-11-20 接收日期:2016-12-25

农业部畜禽种质资源保护项目(2010年度2130135农业资源保护)。

毛翔光(1974-)，男，云南泸西人，高级兽医师，主要从事家畜遗传育种及疾病防治。

S823.2

A

1001-9111(2017)02-0013-04