基于COI基因的西北太平洋金乌贼群体遗传学研究❋

郑小东， 许 然， 池田実， 谷口順彦

(1. 中国海洋大学水产学院，山东 青岛 266003； 2. 中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛266003； 3. 东北大学农学部，日本 仙台981-8555)

基于COI基因的西北太平洋金乌贼群体遗传学研究❋

郑小东1,2， 许 然1,2， 池田実3， 谷口順彦3

(1. 中国海洋大学水产学院，山东 青岛 266003； 2. 中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛266003； 3. 东北大学农学部，日本 仙台981-8555)

对中日海域5个金乌贼群体123个个体的线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)基因片段进行测序，并应用于群体遗传多样性分析。经比对得到454 bp的核苷酸序列，并发现34个多态性位点，单突变位点15个，简约信息位点19个，38个单倍型。群体遗传多样性较高，总群体的平均单倍型多样性指数Hd为0.904，平均核苷酸多样性Pi为0.007 7，平均核苷酸差异数K为3.490。遗传分化系数(Fst)及遗传距离均显示中国日照群体与日本群体之间遗传差异远大于日本群体之间的遗传差异。日照群体与日本4个群体之间的遗传分化系数(Fst)和遗传距离分别为0.642 9～0.725 9和0.012 8～0.014 3之间；日本爱知、爱媛、长崎、福井等群体之间遗传分化较小。单倍型网络图及贝叶斯树均表明5个金乌贼群体分为2大支系，4个日本群体为一个支系，中国日照群体单独为一支系。Tajima’D检验和Fu’sFs检验及核苷酸错配分布说明，5个群体近期可能经历过种群扩张事件。

金乌贼；细胞色素氧化酶亚基I；群体遗传；遗传多样性

金乌贼(Sepiaesculenta)俗称墨鱼，主要分布于中国沿海、日本南部沿海、菲律宾群岛等海域[1-2]，多群居于暖温带浅海性地区，水深在10～100 m左右。金乌贼成体胴体长约20 cm，体型较大，生命周期多为1 a。产卵季节多移至浅海，产卵量较大，分多次产卵，1次产卵量约为23～65个，附着于大型藻类或细枝、细绳上[3-4]。金乌贼是我国北方地区重要的海产经济种类，其肉质鲜美，营养丰富，墨汁有极高的药用保健价值，因而具有极高的市场价值[5]。近年来，因捕捞量过大，环境污染，产卵场所被破坏等多种人为原因导致金乌贼的资源量急剧下降。为恢复金乌贼种质资源，山东等多地开展了金乌贼的增殖放流工作。

近年来，国内已开展了众多金乌贼相关的研究，主要包括金乌贼生物学特性研究[6]、增养殖技术研究[7]、胚胎发育研究[8]及遗传多样性研究[9]等。而在分子遗传学方面做的研究较少，仅Zheng等[9]使用微卫星序列对中日沿海地区金乌贼群体遗传变异进行过研究。线粒体COI基因因其进化速率高，不发生重组，结构简单，被广泛用于头足类动物的分子鉴定和系统学研究中[10]，但尚未见用于金乌贼群体遗传学的相关报道。

本研究利用线粒体COI基因作为分子标记对来自中日海域的5个金乌贼群体的多样性水平及群体遗传结构进行分析，旨在为种质资源保护和合理开发利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2005年10月—2006年3月间采集中日沿岸5个金乌贼群体：其中福井(Fukui)(135°34′E, 35°24′N)群体共22只，长崎(Nagasaki)(129°21′E, 32°30′N)群体共21只，爱媛(Ehime)(132°39′E，33°45′N)群体共25只，爱知(Aichi)(137°03′E，34°31′N)群体共26只，中国日照(Rizhao)(119°21′E，35°05′N)群体共计29只

(见图 1)。取小块胴体部肌肉保存至75%酒精中用于实验，剩余部分先用10%福尔马林固定一周后再转至75%的酒精中长期保存[11]。

图1 金乌贼群体采样分布点

1.2 DNA提取和PCR扩增

取胴体部肌肉约0.1 g，采用改良的十六烷基3甲基溴化铵法(CTAB)法提取DNA并检测质量。利用COI的通用引物LCO1490和HCO2198进行PCR扩增[12]。反应体系为50 μL∶5 μL Buffer，5 μL dNTP，0.25 μLTaq酶，上下游引物各1 μL，36.75 μL dH2O。PCR扩增的程序为：94 ℃(3 min)，94 ℃(45 s)，50 ℃(1 min)，72 ℃(1 min)，34个循环，72 ℃(15 min)，12 ℃。PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物检测后采用ABI PRISM 377 DNA自动测序仪测序。

1.3 数据分析

将得到的双向序列用SeqMan软件根据峰值图进行比对，拼接矫正[13]。将拼接矫正后的DNA序列导入MEGA 6.0软件，进行ClusterW同源序列比对，确定序列的长度、 遗传距离及碱基组成等， 并基于遗传

距离建立Neighbor-joining(NJ)树[14]。利用DNAsp计算碱基突变位点，总群体及各个群体的单倍型数和单倍型指数，多态性位点，平均核苷酸差异数等基因多样性指数[15]。使用ARLEQUIN[16]软件进行分子变异方差分析(AMOVA)，并计算群体内及群体间的遗传分化系数(Fst)，重复次数为10 000次。使用Popart1.7基于TCS法建立单倍型网络关系图[17]。使用Jmodeltest 2.1分析最佳模型[18]，并用该模型在Mrbeyes软件中建立贝叶斯树[19]，结果在Figtree 1.4中呈现[20]。利用Tajima’D检验和Fu’sFs检验来测试中性假说是否成立，用错配分布来检测群体历史上群体动态是否发生变化。根据公式t=τ/ (2μk)计算种群扩张时间，其中k为序列长度，μ为核苷酸突变的速率。

2 结果与分析

2.1 金乌贼群体遗传多样性分析

测序得到550 bp左右序列，经SeqMan矫正去引物序列后得到454 bp的等长同源序列。利用ClusterW比对对金乌贼5个群体123条COI序列进行分析，其中A、T、C、G含量分别为28.3%，36%，19%，16.7%，AT含量明显高于GC含量，各群体碱基组成相近。123条同源序列中共出现34个多态性位点，单突变位点15个，简约信息位点19个；38个单倍型，其中爱媛群体最多13个，长崎群体最少9个，爱知，福井和日照群体各10个。总群体的平均单倍型多样性指数为0.904，平均核苷酸多样性为0.007 7，平均核苷酸差异数为3.490，多样性指数均显示金乌贼的遗传多样性相对较高。金乌贼5个群体的单倍型多样性指数在0.694 6～0.866 7之间，日照群体的单倍型指数Hd最低，长崎群体的单倍型指数Hd最高，如表1所示。5个群体核苷酸多样性指数Pi在0.002 9～0.005 1之间，平均核苷酸差异数K在1.332 3～2.304 8之间。核苷酸多样性指数是衡量群体多样性的一个重要指标，爱知和福井群体的多样性相对较低而长崎群体遗传多样性最高。

表1 金乌贼各群体遗传多样性参数

Note：①Sampling sites; ②Number of sequence; ③Number of haplotypes; ④Number of transition; ⑤Number of transversion; ⑥Haplotype diversity; ⑦Nucleotide diversity; ⑧Mean number of pairwise differences

2.2 金乌贼群体遗传结构

中国日照群体与4个日本群体之间存在显著遗传差异。如表2所示，日照群体与4个日本群体间的遗传分化系数在0.642 3～0.725 9之间，显著大于4个日本群体相互之间的遗传分化系数。爱知群体与其它3个日本群体的遗传分化系数(Fst)在0.207 3～0.300 8之间，且呈显著水平，大于其它3个日本群体相互间的遗传分化系数。爱媛与福井、长崎及福井之间遗传分化系数Fst差异不显著。各群体之间的遗传距离也显示，日照群体与其他4个日本群体的遗传距离显著大于日本群体相互之间的遗传距离，日照群体与其他4个群体的遗传距离在0.012 8～0.014 7之间，而4个日本群体之间的遗传距离在0.039～0.052之间，差异不大。

表2 金乌贼群体之间遗传分化系数(左下)及遗传距离(右上)

注：*表示差异显示，P<0.05。

Note：*Indicates significant level atP<0.05。

单倍型网络关系图(见图2)显示，4个日本群体以H3和H1为中心聚在一起，而中国日照群体主要以H28为中心呈放射状分布，H1和H28之间存在5个碱基的差异。根据距离法建立NJ树如图3所示，NJ树显示的拓扑结构中日照群体单独成一支系，与4个日本群体形成姐妹支系。4个日本支系中福井和爱媛先聚为1支，再与爱知聚在一起，最后与长崎群体聚成一支。利用Jmodel test选择得到的最佳进化模型为GTR+I，使用该模型建立贝叶斯系统进化树如图4所示，5个群体的聚类分析可分为2大支系，即中国日照支系(clade CHN)和日本支系(clade JPN)。中国日照群体与日本群体之间存在显著的遗传分化，除2个日照个体外，其他日照群体均聚成一支。日本支系中因爱知群体与其他3个日本群体之间存在遗传分化，而福井、长崎、爱媛3个群体之间未发现显著遗传结构，聚类分析中日本支系又分为3个分支系，分支系1 (Subclade 1) 以日本爱媛，福井和长崎3个群体为主，爱知所占比例较少，分支系2 (Subclade 2) 则以爱知群体为主，部分来自其他四个群体的个体，分支系3 (Subclade 3) 则由2个日照个体和1个爱知个体组成。AMOVA分析中(见表3)，将5个群体分为1组时，群体间差异占54.83%，群体内差异占45.17%；而将4个日本群体分成1组，日照群体单独分成1组时，结果显示，组间的差异占67.23%，组内群体间差异占4.41%，群体间差异占28.37%，进一步表明中日群体之间存在显著的遗传结构。

图2 金乌贼5个群体单倍型网络图

变异来源①自由度②方差总和③变异组分④变异贡献率⑤群体间⑥4129．341．27607Va∗∗54．83群体内⑦118124．041．05123Vb∗∗45．17组间⑧1113．4502．43634Va67．23组内群体间⑨314．3130．15968Vb∗∗4．41群体间⑩118121．3141．02808Vc∗∗28．37

注：**表示差异极显著，P<0.01。

Note：** indicat significant level at P<0.01.

①Source of variation; ②Degree of freedom; ③Sum of squares; ④Variance component; ⑤Percentage variation; ⑥Among population; ⑦Within population; ⑧Among groups; ⑨Among populations within group; ⑩Within groups

图 3 基于遗传距离建立的金乌贼群体NJ树

2.3 金乌贼群体历史动态性分析

如表4所示，对金乌贼5个群体进行的Tajima’D和Fu’sFs分析，结果均为负值。但是在Tajima’D分析中福井群体和日照群体结果显著偏离中性突变，其他3个群体结果不显著；而Fu’sFs显示，爱知，爱媛和福井群体结果显著偏离中性突变，而日照和长崎结果不显著。利用ARLEQUIN进行错配分析研究群体历史动态，SSD(Sum of the Square Deviations )和Rag(Raggedness index)的P值都显著大于0.05，不拒绝群体扩张假说。综上，本文认为金乌贼群体历史上可能经历过种群扩张事件。本文采用软体动物COI基因的替代速率为每百万年2%[21]，由公式t=τ/ (2μk)估算出日本群体的种群扩张时间约在6～10万年前，而日照群体的扩张时间约为45万年前。

图4 基于线粒体COI基因的贝叶斯系统发生树

群体PopulatronsτSSD(PSSD)Rag(PRag)Tajima’DFu’sFs福井Fukui1．45310．0016(0．8602)0．0651(0．5270)-1．6397∗-6．0127∗长崎Nagasaki1．15630．0025(0．8242)0．0340(0．7778)-1．2976-2．5806爱媛Ehime1．86130．0028(0．8102)0．0209(0．9572)-1．4988-7．5911∗爱知Aichi1．44340．0071(0．3581)0．0977(0．2095)-1．3982-5．7245∗日照Rizhao8．26170．0422(0．5174)0．0935(0．6590)-1．6169∗-2．9332

注：*表示差异显示，P<0.05。

Note:*indicate significant lavel atP<0.05.

3 讨论

近年来，分子标记技术如微卫星标记(SSR)、单核苷酸多态性标记(SNP)、扩增片段长度多态性标记(AFLP)及线粒体COI基因等已被广泛应用于群体遗传学研究中。这些分子标记均能较好揭示群体的遗传多样性但也有不足之处[22-23]。线粒体COI基因虽为母系遗传基因，但因其进化速率快，灵敏度高，目前仍广泛使用于群体遗传学研究[24-25]。

物种的遗传变异是进化和种群历史事件平衡的结果，导致不同群体间同质性或者异质性的转变。群体内和群体间的遗传变异揭示了物种经历的遗传与进化事件，如基因漂变、种群迁移、自然选择、种群扩张等[26]。物种遗传变异的高低以遗传多样性来反应，遗传多样性较高的物种对生态的适应能力强于遗传多样性低的物种。本文研究的金乌贼群体的遗传多样性相对较好，甚至高于同科的无针乌贼(Sepiellajaponica)[27]。5个金乌贼群体中，长崎的遗传多样性较高，而爱知和福井的多样性相对较差。中国日照群体与日本群体之间有显著遗传分化，除2个个体外，其它日照个体全聚为1支，中日群体存在明显的遗传结构。在中日群体形成的2大支系中有少数单倍型在不同支系之间出现交叉，这可能与群体之间的遗传渗透有关。日本东北部海岸的爱知群体与日本爱媛、长崎、福井3个群体之间存在遗传分化(Fst: 0.207 3～0.300 8)，但爱知群体与其他3个群体之间遗传距离差异较小，因此4个日本群体之间没有明显的遗传结构。

对于多数游泳性的海洋生物而言，海洋环境缺乏有效的屏障，海洋生物的遗传结构与生物的扩散能力有很大关系[28-29]。金乌贼营底栖生物，卵多附着于浅海海藻、珊瑚或细枝上，进行长距离的运动能力有限[1]。Tajima’D和Fu’sFs及核苷酸错配分布结果说明这5个群体可能经历过历史上的种群扩张事件。日本群体扩张时间在6～10万年前，日照群体扩张约发生在45万年前，结合当时的历史事件，我们推测造成这种分布格局的因素可能与冰期事件及金乌贼本身的扩散能力有关。因为该时期的冰川作用，很多边缘海裸露成陆地，大量栖息地丧失，很多海洋动物被迫向深海避难所迁移。冰期后，海平面上升，各避难所的种群重新扩张，占据新的栖息地，从而造成了中日之间群体遗传结构的出现[30-31]。

4 结语

中日群体之间有显著的遗传结构，爱知、爱媛、福井、长崎群体之间无明显遗传结构。此外，本研究也为金乌贼的种质资源保护和增殖放流工作提供了重要启示。单倍型多样性是衡量群体遗传变异的重要指标之一。日照群体的单倍型多样性相对较差，因此，今后应对该地区的金乌贼资源进行合理保护和管理。

致谢：感谢日本爱媛县中予水产试验场清水孝昭先生、爱知县水产试验场服部克也先生、福井县水产试验场畑中宏之先生及西海区水产研究所中川雅弘博士在样品采集方面提供的帮助。感谢日本海洋地球科学与技术局奧谷喬司教授在样品鉴定上的大力帮助。

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Abstract: Barcoding fragments of mitochondrialcytochromecoxidaseI(COI) gene of 123 individuals from fiveSepiaesculentapopulations along coastal waters of China and Japan was amplified and sequenced to explore the population genetics of this species. After blast analysis, a total length of 454 bp nucleotides was obtained including 34 polymorphic sites (15 singleton sites and 19 parsimony informative sites) and 38 haplotypes. Relative high genetic diversity was detected, and the average haplotypes diversity (Hd) was 0.904, while the nucleotide diversity(Pi) and the average number of nucleotide differences(k) were 0.007 7 and 3.490 respectively. BothFst and genetic distance of five populations indicated that pairwise divergence between China population(Rizhao) and Japan populations was larger than those among Japan populations.Fst and genetic distance between Rizhao and the other four populations were 0.642 9～0.725 9 and 0.012 8～0.014 3 respectively. And genetic differentiation in pairwise Aichi, Ehime, Nagasaki and Fukui was relatively small. All the five populations fall into two major clades which comprised of one Rizhao population and four Japan populations respectively in Haplotypes network and Bayesian phylogenetic tree.Tajima’D, Fu’sFs test and mismatch distributions all suggested that the possibility of historical expansion.

Key words:Sepiaesculenta； mitochondrialCOI； population genetics； genetic diversity

责任编辑 高 蓓

Population Genetics onSepiaesculenta(Cephalopoda: Sepiida) in the Northwestern Pacific Based on MitochondrialCytochromecOxidaseI

ZHENG Xiao-Dong1, XU Ran1, Minoru Ikeda2, Nobuhiko Taniguchi2

(1. Ocean University of China, Fisheries College, Qingdao 266003, China; 2. Institute of Evolution and Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；3. Tohoku University, Graduate School of Agricultural Science, Sendai 981-8555, Japan)

国家自然科学基金项目(30600463)资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (30600463)

2017-03-13；

2017-04-19

郑小东(1971-)，男, 教授。E-mail: xdzheng@ouc.edu.cn

S931.5

A

1672-5174(2017)09-055-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20170078

郑小东， 许然， 池田実, 等. 基于COI基因的西北太平洋金乌贼群体遗传学研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(9): 55-61.

ZHENG Xiao-Dong, XU Ran, Minoru Ikeda,et al. Population genetics onSepiaesculenta(Cephalopoda: Sepiida) in the Northwestern Pacific based on mitochondrialcytochromecoxidaseI[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(9): 55-61.