基于微孔板对野生樱桃李果皮色素提取工艺的研究

张相锋　焦子伟　杨晓绒

摘要：通过传统的固液萃取法，以微孔板分光光度技术结合正交试验设计，对野生樱桃李果皮色素提取进行了研究，确定了野生樱桃李果皮色素的吸光特性在512nm处。发现考察因素对色素提取效果影响的顺序为：料液比>乙醇浓度>提取温度>提取时间，最优提取条件为乙醇浓度50%，提取时间1h，料液比1：15，提取温度为55℃。但是这一最优组合在正交试验组中没有出现，因此我們可以在后续试验中以料液比、乙醇浓度、提取温度为主要考察因素，以正交试验结果的最优工艺为参数，进行响应面法优化，以便进一步提高提取工艺的高效性。

关键词：固液萃取法；微孔板；正交试验设计；野生樱桃李果皮；色素

多酚是一种对人类健康非常有益的植物次生代谢物。植物体内有很多种多酚，比如在花卉、水果、蔬菜中以各种艳丽的颜色出现的天然色素类物质花青素。花青素是抗氧化剂，具有很强的清除自由基能力，通过提供质子，减弱高活性的自由基的氧化性。同时，花青素类物质还具有抗菌、抗病毒、抗感染等活性。长期摄入富含花青素的食物可以降低患癌症、心血管疾病、病毒感染、老年痴呆症和糖尿病的风险同。还有试验证明，花青素还可以改善夜视能力。它们作为天然色素添加剂，广泛应用于食品和饮料行业，另外在化妆品和油漆行业也有应用。

随着人们健康意识的增强，对食品安全关注度越来越高。许多国家开始逐步禁止合成色素类食品添加剂的使用，取而代之的是安全无毒的天然色素。我国天然色素产业已初具规模，天然色素总产量已达10余万t，最具代表性的有焦糖色素（即糖色）、栀子黄、栀子蓝、姜黄、苋菜红、辣椒红、茶色素。

野生樱桃李（Prunusdivaricata Ldh）为重要的野生果树资源，在我国仅分布于新疆伊犁霍城县，已列为国家重点二级保护植物。从果实颜色来看，自然条件下分布的野生樱桃李的果实有红色、棕红色、紫黑色和黄色果等类型。

我们通过研究发现，野生樱桃李果色主要由其果皮颜色决定，其中紫黑色果实果皮色素含量最高。新疆当地哈萨克族牧民自制野生樱桃李果酱颜色亮丽，而且长期储藏不退色，因此我们以野生樱桃李紫黑色果实的果皮为材料，对其色素提取工艺进行了深入的研究，以便为今后开发新的天然色素资源奠定理论基础。

1.材料与方法

1.1材料与试剂

野生樱桃李紫黑果采于新疆伊犁州霍城县大西沟；乙醇为分析纯。

1.2仪器与设备

酶标仪：Thermo scientific Mutiscan GO；HH-4数显恒温水浴锅；SHZ-D9（Ⅲ）循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；800型离心机：上海磁极器材厂；96孔酶标板：康宁。

1.3试验方法

1.3.1确定野生樱桃李果皮色素的最大吸收波长。准确称取已备好的野生樱桃李果皮样品10.000g，用100mL的50%乙醇，提取温度为50%，回流时间为1h，抽滤，离心，用pH值1.0的KCl缓冲液以1：10对色素原液进行稀释。取稀释好的色素提取液150ul，加入96孔酶标板，在酶标仪上于波长为400～760nm范围内进行扫描，以50%的乙醇为空白对照，进行光谱扫描，筛选出野生樱桃李果皮色素提取液的最大吸收波长。

1.3.2提取方法。准确称取10.000g野生樱桃李果皮样品，经回流、抽滤、离心、稀释，根据试验1.3.1测得的吸光特性，用最大吸收波长测定不同滤液的吸光度。

1.3.3单因素试验。以乙醇浓度、料液比、温度、提取时间作为影响野生樱桃李果皮色素提取效果的因素，以色素提取液的吸光度作为野生樱桃李果皮色素提取效果的评价指标。吸光度测量于96孔酶标板，以相应提取液作为空白对照，每孔上样量为150ul，用酶标仪测量吸光度值，每组试验重复3次。

（1）乙醇浓度的选择。准确称取10.000g野生樱桃李果皮样品5份，按料液比1：8取分别加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液混匀，置于60%条件的电热恒温水浴锅中，回流浸提1h。用酶标仪测吸光度值。

（2）料液比的选择。准确称取10.000g野生樱桃李果皮样品5份，再分别按料液比（1：10、1：12、1：14、1：16、1：18）加入50%的乙醇溶液混匀，再分别倒入相应编号的回流瓶中，置于60%条件的电热恒温水浴锅中，回流浸提1h。用酶标仪测吸光度值。

（3）提取温度的选择。准确称取10.000g野生樱桃李果皮样品5份，再分别按料液比1：10加入50%的乙醇溶液混匀，再分别倒入相应编号的回流瓶中，再分别于30°C、40°C、50%、60°C、70°C条件的电热恒温水浴锅中，回流浸提1h。用酶标仪测吸光度值。

（4）提取时间的选择。准确称10.000g野生樱桃李果皮样品5份，再分别按料液比1：10加入50%的乙醇溶液混匀，再分别倒入相应编号的回流瓶中，于50°C条件下的电热恒温水浴锅中，分别回流浸提0.5h、1.0h、1.5h、2h。用酶标仪测吸光度值。

1.3.4正交设计优化试验。在上述单因素试验的基础上，综合以上试验分析结果，根据正交试验设计原理，以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个影响因素为考察对象，以野生樱桃李果皮色素提取液的吸光度值为参考值进行正交试验，分析野生樱桃李果皮色素提取的最优提取方案，正交试验设计的因素与水平表如表1所示。

2.结果与分析

2.1野生樱桃李果皮色素的吸光特性

由图1可以看出，野生樱桃李果皮色素在pH值1.0的KCl缓冲液中在可见光区512nm处有最大吸收峰，由此确定，野生樱桃李果皮色素在pH值1.0条件下最大吸光特性为可见光512nm，由于溶液pH值对色素的吸光特性有很大影响，因此后续试验吸光度值测定均用pH值1.0的KCl缓冲液进行稀释，在512nm条件下进行吸光度测量。endprint