分子生物学检测技术在我国进出境植物检疫中的应用及展望

金光耀 庄黎萍

摘要 综述了目前国际植物检疫上常用的实时荧光定量PCR技术、DNA条形码技术的发展和技术特点，分析了这2种技术在进出境植物检疫中的应用现状、存在不足以及技术局限性，并对分子生物学检测技术在我国进出境植物检疫中的应用前景做了展望。

关键词 植物检疫；分子生物学技术； 应用； 展望

中图分类号 S41-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0100-03

Abstract Development，technical features of realtime fluorescent quantitative PCR and DNA barcode in the entryexit plant quarantine inspection were reviewed.We analyzed the present situation of the application，shortcomings and limitations of those two technologies in entryexit plant quarantine of China.The application of molecular biological technique in entryexit plant quarantine of China were prospected.

Key words Plant quarantine；Molecular biology technology；Application；Prospect

随着现代生物技术的不断进步，特别是分子生物学检测技术的发展，植物检疫技术得到了极大提升，在病虫害检测方面尤为突出。随着我国国际贸易不断扩大，特别是加入WTO以来，大量外来有害生物随货物流入我国国境，我国进出境植物检疫面临着前所未有的巨大挑战。有害生物检测鉴定是植物检疫执法中一个重要的环节，形态学鉴定作为传统植物检疫检测手段虽发挥着主导作用，但由于其自身存在诸多缺陷，越来越不适应当前我国进出境植物检疫执法对病虫害快速、精准鉴定的需求。笔者就目前主流的实时荧光定量PCR技术、DNA条形码技术在我国进出境植物检疫中的应用及其对未来植物病虫害检测发展方向产生的影响进行了综述和分析。

1 分子生物学检测技术的发展

目前酶联免疫吸附技术（EnzymeLinked Immunsorbent Assay， ELISA）已被广泛应用于植物病毒、真菌、类菌质体等的检测中[1-2]。随着生物检测技术的不断发展，从免疫学技术到核酸技术，从核酸探针、RFLP技术到PCR技术，植物检疫检测技术正在不断优化，以适应科技进步发展的需要[3]。以PCR技术、DNA条形码技术为代表的生物检测技术已被广泛应用于农业、医学等领域。

1.1 實时荧光定量PCR技术

1985年美国Perkin-Elmer Cetus 公司人类遗传研究室研究人员发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），使体外无限扩增核酸片段成为现实[4]。自PCR技术发明以来，该技术已被广泛应用于医学诊断、新型农业、检验检疫、国防军事、基因工程等领域。随着PCR技术的不断推新，传统的PCR技术由于步骤繁琐、耗时长、非特异性、致癌物质使用等原因，其应用受到很大限制。1992年提出来一种新型PCR技术——实时荧光定量PCR技术。1996年美国Applied Biosystems公司成功推出该技术[5]。与传统PCR技术相比，它具有快速、灵敏、特异性强、自动化程度高、重复性好、定量准确等特点。随着应用的推广，该技术正在被各行业认可，特别是在检验检疫系统中，实时荧光定量PCR技术已经被广泛用于检测植物病害、虫害，不仅有效遏制了外来有害生物的入侵，而且在破除对外贸易技术壁垒、解决国际贸易纠纷上发挥了重要作用。

1.2 DNA条形码技术

DNA条形码技术是通过对一段标准化基因DNA序列的分析来实现对生物物种准确、快速鉴定的技术。该技术自2003年诞生以来，备受科学界关注，特别是在生物分类学领域已被广泛采用，并改变了生物分类学的发展方向。Taulz等于2002年首先提出了DNA分类概念，即以DNA序列为基础建立物种鉴定体系。随后在2003年，Hebert等提出建立以线粒体细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因5端648 bp的序列多样性为基础的条形码鉴定系统，运用COI基因的序列多样性对全球动物进行编码，由此形成了成熟的DNA条形码技术[4]。2004年，国际性合作组织生命条形码联盟建立，旨在开发出一套完整的条形码标准流程和构建一个全面的条形码数据库。DNA条形码技术很快在植物检疫中得到应用，如应用DNA条形码技术对新西兰边境截获的毒蛾和果蝇标本进行重新分析，发现其与传统PCR技术相比，具有灵活性、预测价值等优势[6]。国内学者魏书军等[7]和张桂芬等[8]分别应用DNA条形码技术对美洲棘蓟马（Echinothrips americanus Morgan）和西花蓟马（Frankliniella occidentalis Pergande）2种入侵性害虫进行鉴定，均取得了很好的结果，充分展示了DNA条形码技术在植物检疫，特别是在外来有害生物物种鉴定方面广阔的应用前景。

目前，DNA条形码技术已在动物、植物、微生物物种鉴定方面得到了应用。虽然该技术具备众多优点，但由于生物物种的多样性和物种基因间差异等因素，该技术仍有许多不足之处，如假基因的存在、线粒体基因遗传的固有风险、COI进化速率的差异、种内差异和种间差异的重叠等因素都会对最终结果产生影响，从而造成误判。另外，基因库的建立是一个长期过程，同时还涉及基因库数据共享的知识产权专利问题，因此，DNA条形码技术尚处于开发阶段，离大规模应用还有段距离。

2 我国进出境植物检疫主要检测技术特点及应用现状

2.1 传统植物检疫检测技术

我国进出境植物检疫工作涉及植物及其产品或其他检疫物的现场查验、实验室检测、预防消毒与检疫处理、疫情监测与控制，其中实验室检测是植物检疫过程中的重要环节，检测结果的准确与否直接影响到植物检疫人员的结果判定，其中病虫草害鉴定是植物检疫实验室最主要的检测项目。形态学鉴定、免疫学技术是有害生物传统检测方法。

形态学鉴定一直以来都是最常用的一种植物检疫检测技术，形态学鉴定方法虽然简便、快速，但也存在以下缺陷：

①被用作鉴定的特征如果存在表型可塑性和遗传可变性将会导致错误的鉴定结果。此类情况在进出境植物检疫中经常遇到，截获的昆虫等有害生物由于生存环境、个体发育等原因使得个体间产生差异，例如在体色、体长以及其他局部细微特征（如复眼间距、2种特征长度间的数学关系等）上与鉴定资料描述有出入，导致鉴定人员无法做出正确的判断。②形态学鉴定通常是针对生物某一特定发育阶段或者性别才能识别。近年来，在进出境植物检疫查验中，截获了大量外来有害生物样本，但由于货物种类、地理差异、运输方式、除害处理等原因，多数只能截获到昆虫卵块、幼虫、蛹，甚至是残体，利用形态学鉴定无法进行精确定种，只能分到大类，这样就会造成在检疫执法中由于判断依据不足而无法实施正确检疫处理的后果，如果其中存在检疫性有害生物，后果将不堪设想。③形态学鉴定方法忽略了许多类群中普遍存在的隐存分类单元，如昆虫分类中对某些分类阶元仍存在学术争议。④形态学鉴定需要鉴定人员具备扎实的专业知识。“三检合一”以来，我国进出境植物检疫有了长足进步，人员队伍不断壮大，技术力量持续提升，但随着业务量的快速增加、检测难度的迅速提升、检测方法的日益复杂、管理制度的规范完善，植物检疫实验室传统的工作模式难以适应对植物检疫检测技术的更高需求，检疫人员既要应对繁杂的业务查验，又要耗费大量时间、精力从事以形态学鉴定为主的实验室检测工作，致使其难以专心从事、研究实验室检测工作[9]，这个已成为制约基层进出境植物检疫实验室发展的核心问题。

自20世纪70年代酶联免疫吸附技术发明以来，免疫学技术作为一项新型分子生物学检测技术已被广泛应用于植物病害检测中，之后相继衍生出免疫荧光技术、斑点免疫技术、免疫电镜技术等检测方法。免疫学技术虽然为植物病害检测提供了相对准确的检测结果，但由于检测周期长、工作量大、试剂盒成本高、抗干扰能力不强等不利因素较多，在植物检疫检测领域，免疫学技术正逐渐被PCR技术、DNA条形码技术所代替。

2.2 实时荧光定量PCR技术

随着我国外向型经济的发展，“质量兴国、科技兴检”战略持续深入推进，基层植物检疫实验室有了长足发展，有害生物鉴定方法也有了较大改变，从传统的单一形态学鉴定方法逐渐变成以形态学鉴定为主，血清学技术、PCR技术等其他新型物种检测技术为辅的多元化结构方向发展，其中以实时荧光定量PCR技术为代表的新型有害生物鉴定方法，已经在部分植物检疫实验室得到应用，并取得了初步成果。2009年，为应对北美植物保护组织（NAPPO）正式通过的《来自亚洲舞毒蛾疫区船舶及货物操作管理指南》（NAPPO植物卫生措施区域标准第33号）对我国对外贸易的严重影响，我国检验检疫科研人员运用分子标记技术进行了地理种群分析，最终证明北美种群与亚洲种群明显分为2支，支持率达100%，成功化解了此次贸易壁垒。2010年，江苏检疫局植物检疫实验室运用 PCR 方法首次从加拿大输华油菜籽中检出十字花科小球腔菌（Leptosphaeriq maculans），并连续检测出 5批次，病原菌的检出率达80%。同年，江苏检验检疫局植物检疫实验室使用特异性引物扩增的方法，从美国进境紫花苜蓿干草中，检疫出我国禁止进境的检疫性真菌病害苜蓿黄萎病（Verticillium wilt）。可见， 实时荧光定量PCR技术是我国进出境植物检疫中不可或缺的高端检测技术。

虽然实时荧光定量PCR技术已趋成熟，但在植物检疫领域的应用还不够多，主要是由于：①地方经济、口岸条件、植检业务不一，许多口岸植物检疫实验室基础差异较大，具备PCR检测能力的实验室较少；②传统形态学鉴定较为简单便捷、易于上手，在植物检疫检测中仍是最常用的检测方法；③相对繁琐的PCR操作流程无法满足大量的外来有害生物样品检测任务；④我国尚未建立外来有害生物基因库，对该技术的推广应用造成了一定影响。

2.3 DNA条形码技术

DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术，是近年来生物分类和鉴定的研究热点。该技术在鉴定物种、发现新种和隐存种，重建物种和高级阶元的系统演化关系等领域具有广泛的应用前景。 近年来，DNA条形码技术在我国植物检验检疫中得到普遍应用，取得了不少成果。如昆虫DNA条形码试剂盒检测技术针对我国出入境植物检疫性及危险性昆虫的主要类群，选择合适的目标基因片段，设计通用引物，提高了扩增效率。将目标基因序列上的多态位点规律作为物种的鉴定特征（基因条码特征），为检疫性物种建立身份证，构建昆虫基因条码数据库，用于检疫性及危险性昆虫的鉴定。通过比对数据库中的基因条码特征，可以确定未知昆虫样品的分类地位，并准确将其与近似种区分开来，有效避免了误判，实现了精准鉴定。

2.4 分子生物学检测技术对传统形态学鉴定方法仍有依赖性

形态学鉴定方法以生物遗传规律为标准，对世界生物物种库的建立起到了决定性作用。虽然近年来实时荧光定量PCR技术等分子生物学检测技术在有害生物鑒定方面的优势逐渐显现，但形态学鉴定技术仍具有不可替代性和自身优势。首先，分子生物学检测技术的基本原理是采用DNA序列比较法，比较的前提是先采用形态学鉴定方法确定模式标本，因此，分子生物学检测技术是建立在形态学鉴定的基础之上的；其次，相比分子生物学技术，形态学鉴定仍是快速、简便的检测方法，也是我国进出境植物检疫常用的检测方法之一。

2.5 实时荧光定量PCR技术、DNA条形码技术应用具备的优势及存在问题

实时荧光定量PCR技术、DNA条形码技术通过分析物种条形码序列，不仅可以实现快速、直接地为基于形态的分类系统提供必要信息，而且可以根据已知基因条码进行精确定种，与传统形态学鉴定相比具有定位误差小、人为干扰少、依据充分可靠、检测范围大等优势，非常适合应用于进出境植物检疫工作，尤其是在有害生物风险分析、处置外来有害生物突发事件、研究对外贸易技术壁垒、建立检疫性有害生物基因数据库、开展形态学鉴定能力验证、活体非成虫态有害生物的物种确认等方面有着不可估量的应用价值。虽然这2种技术已趋成熟，但现阶段对于我国进出境植物检疫工作来说仍存在以下不足：①外来有害生物特别是检疫性有害生物基因条码数据库的建立尚处于初始阶段，目前只有江苏检验检疫局植物检疫实验室等少数实验室开展了相关研究工作，从全国范围来讲尚未形成合力，因此对其应用开展有一定制约性；②实时荧光定量PCR技术、DNA条形码技术对设施设备要求高、专一性强，投入高且无收益，加上全国各口岸基础条件不一，全面推广尚有难度；③分子生物学检测虽然解决了对专家的依赖性，但由于该技术对操作者的要求较高，需配置相应的专职人员才能开展；④由于此类技术的局限性，假阳性、检测偏差等问题仍然存在。

3 分子生物学技术在进出境植物检疫中的应用前景展望

分子生物学技术的发展为进出境植物检疫检测技术的进步创造了广阔的空间，同时也为提高疫情疫病检出率、有效防控外来有害生物入侵、研究对外贸易技术壁垒谈判依据提供了强有力的技术支撑。随着我国对外贸易的不断扩大，进口小麦、油菜籽、大豆、木材等大宗农产品大量涌入我国，跨境电商等新兴产业大行其道。在保障国门生物安全的前提下，进一步提高口岸通关速率，这些对我国进出境植物检疫工作提出了新的挑战和要求。实验室检测工作作为植物检疫中必不可少的重要环节，承担着重要使命，同时也面临着巨大挑战。实时荧光定量PCR技术、DNA条形码技术作为目前分子生物学检测常用的2种技术，基本实现了对有害生物的快速、简便、准确检测，但分子生物学检测仍然依赖于传统形态学鉴定技术，而形态学鉴定作为目前我国进出境植物检疫最主要的检测方法，仍将是今后我国进出境植物检疫工作中常用实验室检测方法之一。运用实时荧光定量PCR技术、DNA条形码技术建立完整的外来有害生物物种基因数据库、建立口岸植物检疫PCR实验室、完善有害生物检测技术将成为今后一段时间内我国进出境植物检疫的重要工作内容之一。随着技术的不断进步和试验程序的持续优化，在不久的将来，分子生物学检测技术将成为我国进出境植物检疫中最重要、最常用的技术手段。

参考文献

[1] MONETTE P.葡萄茎尖组培苗中扇叶病毒的酶联（ELISA）检测[J].植物检疫，1991，5（1）：20，21.

[2] 张成良，张作芳.酶联免疫吸附技术：Ⅲ酶联免疫吸附法在检测植物病毒上的应用[J].植物检疫，1982（3）：15-33.

[3] CHUNG H W.Reverse transcriptase PCR （RTPCR） and quantitativecompetitive PCR （QCPCR）[J].Experimental & molecular medicine，2001，33（S1）：85-97.

[4] 赵光宇，李虎，杨梅林 等.DNA条形码技术在昆虫学中的应用[J].植物保护学报，2014，41（2）：129-141.

[5] ARMSTRONG K F，BALL S L. DNA barcodes for biosecurity：Invasive species identification[J].Philosophical transactions of the royal society B，2005，360：1813-1823.

[6] 黄海泉.实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展[J].湖北农业科学，2012，51（1）：5-8.

[7] 魏书军，马吉德，石宝才，等.我国新入侵外来害虫美洲棘蓟马的外部形态和分子鉴定[J].昆虫学报，2010，53（6）：715-720.

[8] 張桂芬，孟祥钦，万方浩.西花蓟马检测鉴定技术研究进展[J].生物安全学报，2011，20（1）：81-88.

[9] 詹国辉，樊新华，顾忠盈.基层动植物检疫实验室发展的思考[J].植物检疫，2009，23（S1）：67-70.