一种基于TaqMan探针法的阪崎肠杆菌qPCR全自动检测技术体系的建立

王芬 刘宽 马龙

摘要 [目的]建立快速准确地检测食物样品中食源性致病菌的体系。[方法]配套湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室自主研发的微生物分子检测仪，建立一种基于TaqMan探针法的阪崎肠杆菌qPCR检测体系。[结果]体系建立成功，标准曲线斜率为-3.44，R2 =0.995 5，扩增效率为95.3%。[结论]该qPCR体系特异性强，灵敏度高，明显缩短了检测时间，并具有良好的稳定性与重复性，为食品中阪崎肠杆菌的高通量和自动化检测提供了一个新的途径。

关键词 阪崎肠杆菌；qPCR；全自动检测

中图分类号 TS207.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0144-04

Abstract [Objective]To establish a rapid and accurate detection system for foodborne pathogens in food samples.[Method]A qPCR detection system for Enterobacter sakazakii based on TaqMan probe method was established，which was supported by the microbial molecular detector researched by key laboratory of Huzhou mocrobilogical agents and agricultural products safety.[Result]The system was successfully established and the standard curve slope，R2，amplification efficiency was 3.44，0.995 5，95.3%，respectively.[Conclusion]The qPCR detection system has strong specificity，high sensitivity，good stability and repeatability，which could shorten the detection time greatly.The system provides a new way for high throughput and automated detection of E.sakazakii in food.

Key words Enterobacter sakazakii； qPCR；Automatic detection

近年來随着社会经济的发展以及一些食品安全事件的普遍发生，人们对食品安全问题越来越关注。引起食品安全问题的因素涉及方方面面，而微生物污染是导致食品安全问题的重要原因之一，其中阪崎肠杆菌污染是一种广泛存在的微生物污染。阪崎肠杆菌即克罗诺杆菌属，耐酸、耐干燥、抗渗透压，在食品、饮料、加工材料、环境中广泛存在并且很容易生存[1-4]。国际食品微生物标准委员会（ICMSF）在2002年将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”[5]。该菌易引起脑膜炎、小肠结肠炎和败血症等疾病，是引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，死亡率高达50%[6-8] 。因此，加强对食品中阪崎肠杆菌的检测对于维护食品安全和维持人体健康尤其是婴幼儿的健康具有非常重要的意义。

目前检测阪崎肠杆菌的方法已有很多，如普通微生物学检测、基于α-葡萄糖苷酶活性的检测、免疫学检测（ELISA、 IMB、 IFA）和分子检测等。其中分子检测法又包括普通 PCR、荧光定量 PCR 、环介导恒温扩增 （LAMP） 等方法[9-10]。国标法对于阪崎肠杆菌的鉴定是增菌培养后以TSA平板上产生黄色素为基础进行生物检测，而黄色素产生并不是阪崎肠杆菌所特有的，同时一些研究也表明，自然界中存在一些不产黄色素的阪崎肠杆菌[11]。与国标法相比，qPCR检测技术的特异性和灵敏度要强得多，并且时间会明显缩短。该研究主要基于TaqMan探针法qPCR检测技术，配套湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室自主研发的微生物分子检测仪以完成阪崎肠杆菌检测体系的建立。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。试验总共涉及5种菌株，其名称与来源见表1。

1.1.2 仪器与试剂。

普通PCR仪为美国BIO-RAD公司生产；台式高速冷冻离心机和加样器均为德国Eppendorf公司生产；微生物智能检测设备为湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室自主研发设计；DNA 提取试剂盒购自湖州高亿诺有限公司；PCR反应试剂购自大连宝生物（TaKaRa）公司；引物与探针为英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 阪崎肠杆菌 qPCR引物与探针。试验涉及引物与探针序列均来自于国家检验检疫总局颁布的标准。引物序列为F：5-GGGATATTGTCCCCTGAAACAG-3，R：5-CGAGAATAAGCCGCGCATT-3；探针序列为5FAM-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3。

1.2.2 细菌基因组DNA提取。

将各菌株的单菌落分别接种于LB培养基中，37 ℃培养12 h完成细菌培养，利用细菌基因组DNA提取试剂盒（GYN106-100T，高亿诺）提取基因组DNA。

1.2.3 引物特异性验证。

提取不同菌种的基因组DNA，利用阪崎肠杆菌的引物和探针进行qPCR验证，确定阪崎肠杆菌检测引物的特异性。

1.2.4 qPCR试验。

反应体系为Premix Ex TaqTM （RR390A，TaKaRa） 12.5 μL，10 μmol/L primer F 2 μL，10 μmol/L primer R 2 μL，10 μmol/L probe S 0.5 μL，模板DNA 2 μL，DEPC处理水6 μL，总体积25 μL。反应条件为95 ℃30 s；95 ℃5 s；60 ℃30 s，40个循环，退火过程中收集荧光信号。每个样品重复3次。

1.2.5 qPCR标准曲线的建立。

分别以阪崎肠杆菌基因组DNA进行10倍稀释，利用超微量核酸测定仪（BioDrop μLite）测定基因组的浓度，以基因组拷贝数的对数与反应循环数（Ct）之间建立标准曲线。基因拷贝数的计算公式为：

1.2.6 面包样品的前处理及基因组提取。

取冷冻干燥后的面包样品0.2 g加入到2 mL离心管中，依次加入100 μL梯度稀释的阪崎肠杆菌菌液，再加入900 μL的超纯水（将阪崎肠杆菌菌液稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6种不同浓度的菌液），涡旋混匀后在4 ℃，12000r/min的条件下离心3 min，弃上清。再利用試剂盒（GYN106-100T，高亿诺）提取基因组。

1.2.7 面包加标样品的qPCR检测。利用“1.2.6”中得到的基因组DNA为模板，进行qPCR验证。

2 结果与分析

2.1 阪崎肠杆菌检测引物的特异性

分别提取阪崎肠杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌5种菌株的基因组，以该5种菌株的基因组为qPCR模板，进行qPCR试验。引物与探针均为阪崎肠杆菌专属的引物与探针。由图1可知，仅有阪崎肠杆菌的基因组模板有对应的Ct值，FAM 通道有明显的扩增曲线；单增李斯特菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌4种菌株基因组模板对应的通道没有明显的扩增曲线，说明阪崎肠杆菌引物的特异性较好，且扩增体系无污染。所得扩增片段送往上海生工测序后证实确为阪崎肠杆菌片段。

2.2 阪崎肠杆菌qPCR标准曲线的灵敏度与重复性

2.2.1 标准曲线的建立。

将阪崎肠杆菌基因组DNA 10倍梯度稀释后，作为qPCR模板DNA，进行qPCR试验。以标准品稀释后对应的拷贝数（copies）为横坐标，Ct值作为纵坐标建立阪崎肠杆菌qPCR标准曲线，结果如图2所示。利用该qPCR体系检测阪崎肠杆菌，标准曲线斜率为 -3.44，R2=0.995 5，扩增效率E为95.3%。

2.2.2 qPCR体系的重复性试验。

为验证该检测体系的重复性，人工污染面包后，提取各不同稀释梯度的人工污染面包的基因组，分别每隔12 h进行1次qPCR检测，总共3次，每次3个重复。由表2可知，3次重复的变异系数为1.30%～3.89%，结果显示该qPCR体系有良好的重复性。

2.2.3 模拟样本检测。

将加有不同稀释梯度阪崎肠杆菌原菌液的面包样品的宏基因组直接作为PCR模板DNA，进行PCR电泳验证，试验结果如图3所示。从图中可以明显看出条带的亮度逐渐变暗，表明面包的人工污染成功。

再将加标面包样品的宏基因组直接作为qPCR模板DNA，进行qPCR试验，试验结果如表3所示。结果表明，未增菌的面包加标样品在系列梯度稀释下，阪崎肠杆菌在37～9.33×105 拷贝/mL浓度条件下均有明显的扩增曲线，因此实际样品中的最低检测限为37拷贝/mL。

3 讨论与结论

qPCR技术因具有快速、灵敏性高、特异性好等特点，近年来在食源性病原微生物的快速检测中大受欢迎，是一种可靠的检测方法。该技术定量和扩增同步进行，克服了PCR的平台效应，有效解决了传统PCR只能终点检测的局限性[15]。

该试验以食源性致病微生物中常见的阪崎肠杆菌为供试菌株，针对

湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室

自主研发的微生物分子检测仪，成功建立了一种配套该仪器的阪崎肠杆菌qPCR检测体系。通过特异性、敏感性、重复性验证结果表明该试验建立的检测体系具有较好的特异性、稳定性和重复性。根据 SN/T 1870—2016[16]，样品在检测前需经过二次增菌才能进行基因组提取，整个qPCR检测过程至少需要3 d；GB 4789.4—2016[17]中的传统培养法以分离培养和生化鉴定为主，最快也需要4 d；黄焘等[18]用Taq Man-MGB 探针法对食品样品中阪崎肠杆菌进行实时荧光PCR检测时（不包括增菌过程）最快需要10 h；而在该研究建立的检测体系中，样品的前处理只需经过简单增菌，不必经过增菌后的选择培养，可直接提取基因组进行检测，并且该试验配套食品有害微生物智能检测设备，可以实现样品富集与处理、核酸提纯、靶基因定量、分析等步骤一体化，是全封闭、一体式自动化检测系统，可以保证样品和试验操作的安全性，降低检测过程污染风险，也可降低人工操作引起的误差，且对从业人员的专业素养要求不高。该体系的检测通量为192个样本/（d·台），整个检测过程不超过16 h，这样不仅缩短了检测时间，又有着常规检测方法和快速检测装备所不能实现的高通量，为食源性致病菌检测提供了理想的平台。

Seo等[19]建立的实时荧光定量PCR方法灵敏性为100 CFU/mL；张朝[20]在用荧光定量qPCR检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究中的测限可以达14.117拷贝/μL；而该研究建立的检测体系灵敏度达37拷贝/mL，且样品的前处理不必经过增菌后的选择培养，直接提取基因组的优势更为明显。

该qPCR检测体系的特异性强，准确性和重复性好，检测下限较低，可以明显提高检测效率和检测通量，该体系的建立可为阪崎肠杆菌的快速检测提供新的参考。但仍不能排除结果中的假阳性，即检测样品中死菌与活菌的区分，另外，是否所有食品样品都适合不经过增菌后的选择培养的前处理这一问题仍需要进一步研究。

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