不同地理居群冰清绢蝶翅脉的几何形态学分析

郝祥瑜 毛增辉 任华

摘要 [目的]研究几何形态学方法在研究蝶类昆虫种内居群间分化的可行性和有效性。[方法]以冰清绢蝶为研究对象，对我国冰清绢蝶主要地理分布区的10个地理居群共200个体翅脉脉相的相关指标进行研究，利用三维数码显微镜共测量、分析前后翅共计17种脉相的几何形态学性状（包括翅脉长度、翅脉两点间线段长度、中室面积等），再利用SPSS 21.0软件对筛选出的有效性状进行了统计和聚类分析。[结果]冰清绢蝶10个地理居群的形态分化和它们的地理分布之间存在明显的相关性；安徽滁州琅琊山的居群在聚类树上的位置较为特殊，没能显示出与其地理分布间的明显关联性。[结论]几何形态学分析方法在蝶类的种内分化研究中是一种十分有效的辅助手段。

关键词 冰清绢蝶；地理居群；翅脉特征；几何形态学；系统分类

中图分类号 Q964 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0084-05

Abstract [Objective] The aim is to investigate the feasibility and validity of the method of geometric morphology in the study of the differentiation among populations of butterflies. [Method]With Parnassius glacialis as study object， related index of 200 individual venation in 10 geographic populations in major geographic regions were studied.Geometric morphological characters （including length of the venation，length of the line between two venation，area of the discal cell，etc.） of a total of 17 kinds of venation of forewings and hindwings were analyzed through threedimensional digital microscope，and then SPSS 21.0 software was used to carry out statistical analysis and cluster analysis on the selected effective characters. [Result] There was a significant correlation between morphological differentiation and geographical distribution of the 10 geographic populations of the Parnassius glacialis；since the location of the cluster in the clustering tree on Langya Mountain in Chuzhou Anhui was special，thus there was not a clear correlation between the geographical distribution. [Conclusion]Method of geometric morphology analysis is a very effective auxiliary means in the study of intraspecific differentiation of butterflies.

Key words Parnassius glacialis；Geographic population；Vein characteristics；Geometric morphology；Systematic classification

在傳统昆虫分类学中，昆虫的翅脉特征（脉相）是一个非常重要的分类学指标。翅脉特征不仅对昆虫的分类鉴定有重要意义，还可以应用于对昆虫的物种多样性、系统发生发育及昆虫在不良环境条件下所发生的变异程度的研究[1]。

几何形态学（Geometric morphometrics）是关于形态定量比较的科学计算工具，是用数学方法描述或分析一个图像形状结构的方法。其研究方法多种多样，但在技术路线上都需要先将形态数据数字化，再比对不同的样本。通过比对可以计算出样本之间的形状和大小差距。这里的比对作用类似分子系统学研究中分子序列比对，意在找到样本之间的“同源信号”和“简约信息位点”。通过比对筛选出有效生物学性状，再用统计学的方法统计聚类。在国外，几何形态学方法已广泛应用于探讨生物的个体发育、种群分化、系统进化等多个方面，研究对象以大动物居多。在国内，仅用于昆虫的分类鉴定及远程自动识别研究中。目前，国内随着计算机图像处理技术的不断发展，以昆虫翅脉特征提取为核心技术的软件也日趋完善，图像数字化处理技术与传统昆虫形态学结合已经充分应用到昆虫种间的分类鉴定中[1-5]，但是运用几何形态学方法研究蝶类昆虫种内居群间分化国内外鲜有报道。

绢蝶属（Parnassius）是绢蝶亚科（Parnassidae）绢蝶族中的一个属，物种繁多，广泛分布于古北界及新北界温带的高山地区，从巴基斯坦到中亚和中国，部分物种扩至到欧洲、日本及北美洲，因物种分布广，各地理因素如山脉、海洋、河流等导致物种隔离，继而演化出许多亚种[6]。我国绢蝶资源丰富，据周尧《中国蝶类志》记载：全世界绢蝶有38种，仅我国就有35种124亚种。主要产于高山上，耐寒力强，仅少数种类分布在低海拔，寄主植物是景天科及紫堇、延胡索等。冰清绢蝶（Parnassius glacialis Butler）是分布在低海拔地区的绢蝶，也是我国江南分布的唯一一种绢蝶，这可能是第四纪冰期的遗留物[7]，主要分布在河南、山东、陕西、湖北、安徽、浙江、江苏、甘肃等地。寄主植物单一（寡食性），主食罂粟科紫堇属（Corydalis edulis Maxim）的延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）和小药八旦子（Corydalis caudata）[6，8-9]。其形态学特征：体黑色，披有黄色长毛，颈部有1轮黄色毛丛。翅色白而稍呈蜡黄，翅质薄而半透明，温润如丝绢，翅脉灰黑褐色。前翅亚外缘有1条褐色带纹。中室内和中室端各有1个黑褐色斑纹；后翅内缘的黑带较宽，上披黄色长毛（图1）[7，10]。

生物地理学是生物学和地理学间的边缘学科，主要研究生物在时间和空间上的分布，并尝试分析和解释物种的地理分布为何呈现如今所见的格局。该研究尝试通过对不同地理居群冰清绢蝶翅脉特征的几何形态学计量，推测冰清绢蝶现有分布格局的形成机制，旨为相关领域研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取冰清绢蝶10个地理居群的标本（每一居群随机抽样20个体），涵括了冰清绢蝶的大部分分布区，具体的采样点信息如表1所示。野外采集的蝶类标本立即投入无水乙醇中（无锡市展望化工试剂有限公司）保存，所取标本均来源于安徽师范大学生命科学学院分子系统学与进化研究室（-80 ℃）样品库内。

1.2 标本处理

取出浸泡在无水乙醇中的蝴蝶，用镊子夹取蝴蝶翅膀的基部，使其完整地脱落，待乙醇挥发完全，在蝶翅下方置垫一小方块白纸，便于与黑色翅脉形成反差；其上盖上一载玻片，将蝶翅压平，放入基恩士VHX-5000三维数码显微镜（日本）中观察测量（分辨率2400DPI）。

1.3 图像获取 利用基恩士VHX-5000三维数码显微镜的图像拼接技术对图像进行采集，形成一张完整的蝴蝶全翅图片，在该数码显微镜的测量工具中，利用鼠标多点连线或两点间连线描摹出翅脉的纹路并且勾勒出所需测量的翅脉长度和面积，即可进行测量。前翅共测得13组数据，后翅共测得4组数据（精度为1 μm或1 μm2），保存拍摄图片以及测量结果生成扩展名为.csv的文件，利用VHX Measurement Data Tabulation Tool软件将数据导出至Excel表格中。

1.4 数据分析

在Excel表格中，整理和统计10个居群共200个绢蝶所测得的翅脉长度和面积，并求出均值，对翅脉长度、蝶翅中室面积、全翅面积等性状进行统计分析，利用SPSS 21.0软件分别对各组数据进行初步系统聚类，筛选出聚类结果相同的一些性状，舍弃部分不适合聚类分析的性状，最后对筛选出的性状进行统计和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 10个冰清绢蝶地理居群的翅脉形态学特征平均值

分别取10个地理居群各20个体冰清绢蝶，测量前翅11组长度数据、2组面积数据；测量后翅2组长度数据、2组面积数据（图2）。求得前后翅翅脉形态学特征平均值（表2、表3），表2为前翅翅脉数据，表3为后翅翅脉数据。根据Excel文档求出P值结果小于0.05，表示各特征值的不同均由不同居群的冰清绢蝶的形态差异引起。

从表2可以看出，南京、连云港、天堂寨、天目山的冰清绢蝶蝶翅面积较大，各翅脉长度相对较长。利用SPSS 21.0对前后翅共计17组数据进行聚类分析，并一一比对，选出聚类分析较为相似的数据共10组，即为有效性状。

2.2 10个冰清绢蝶地理居群的聚类分析树状图

利用SPSS 21.0再将10组有效性状（前翅分别为ab、R1、R5、M1、Cu2、2A、af、中室面积；后翅分别为ab、中室面积）进行聚类分析，绘制出树状图，从树状图得出结论：冰清绢蝶的演化划分为两支，共聚为两大类，一类分为天堂寨、天目山、南京、连云港4个地理居群，另一类分为泰山、嵩山、琅琊山、天水、黄柏塬、神农架6个地理居群。即天堂寨、天目山、南京、连云港这4个地理居群的冰清绢蝶亲缘关系较近，而泰山、嵩山、琅琊山、天水、黄柏塬、神农架6个地理居群的冰清绢蝶亲缘关系较近（图3）。

2.3 冰清绢蝶演化路径推测图

根据聚类树状图绘制成冰清绢蝶演化路径的推测图（图4）。地质学资料显示，大约6 000万年以前，印度板块和亚欧板块碰撞导致的造山运动逐渐形成了青藏高原，包括喜马拉雅山脉[11]。同时，相关的分子系统学和分子钟研究推测，距今2 000万～3 000万年前，绢蝶属物种的祖先在我国西南地区（现今藏东南的横断山脉一带）开始形成[8]，其时，它们已产生了一些适应高海拔环境的特性，如翅膀被毛、耐寒冷、耐低氧等等，随着绢蝶属的分化和物种之间的竞争，以及中新世以后，特别是第四纪期间全球气候变化的影响，冰清绢蝶开始向华中、华北、华东地区迁移，形成2支演化路径：第一支由喜马拉雅山脉经过唐古拉山、巴颜喀拉山，到达位于秦岭的天水、黄柏塬一带，再分为三小支，途经华北平原分别向泰山、嵩山、琅琊山3个方向迁移；第二支由喜马拉雅山脉发源，向东迁移经过秦岭、四川盆地到达天堂寨、南京、天目山等地，最后沿海岸线扩散至连云港一带。成为我国唯一一种分布到长江以南，生活在較低海拔地区的绢蝶，且对生活环境的要求极为苛刻[7，12-13]。

3 结论与讨论

安徽天堂寨位于大别山区，是南北水系的分水岭，属大别山系，地质基础为前震旦纪的秦岭褶皱带，后期受燕山期造山运动的显著影响；浙江天目山和江苏南京紫金山总体上属于宁镇山脉，是侏罗纪末至白垩纪初期，通过宁镇山脉造山运动形成的一条向北突出的弧形皱；江苏连云港云台山的地质基础则属于华北古陆构架。这些古地质事件形成的山脉后来都经过频繁的地质变化过程，最终形成了现在的地质地貌。

甘肃天水属小陇山系，为秦岭的西北缘；陕西黄柏塬地为秦岭腹地；湖北神农架属大巴山系，河南嵩山属伏牛山系，它们都是秦岭造山带的余脉；山东泰山构造基础为古华北地带，后来经漫长而又复杂的演化过程才形成今天的地貌；安徽琅琊山为江淮之间的低山丘陵地带，系大别山系向东延伸而成的余脉。

总体而言，上述地质过程，包括较晚近的燕山运动时期（在地史上主要属于侏罗纪末到古近纪初这段时期，距今2亿1千万年左右开始至6 500万年前为止）相对于绢蝶种群的分化时期而言（据分子钟推测为350万前至30万年前），是一个十分古老的时期，因而，这些地质因素对冰清绢蝶的扩散无关。

综合多方面证据分析，笔者推测，冰清绢蝶不同居群间的扩散路径与其地理分布（相关山脉分布、走向及地理隔离等）之间有明显的相关性，即地质历史上，第四纪开始至今的地质、生物环境和气候变化因素对冰清绢蝶的扩散路径和现代地理分布产生了重要影响[8，11]。譬如，第一进化支（天堂寨、天目山、南京、连云港4个地理居群）各居群的生态环境极为相似，均位于华北平原与长江中下游平原地带，海拔较低，降水丰富，属于亚热带季风气候与温带季风气候交界处；而第二进化支（黄柏塬、神农架、天水、嵩山、泰山5个地理居群）的生态环境类似，海拔相对较高，气温也相对较低，地处内陆，降水相对较少。至于安徽琅琊山的居群，单从地理因素考虑，理论上应属于第一进化支，从而支持安徽师范大学生命科学学院分子系统学与进化研究室利用分子手段分析的结果。但从形态上看，琅琊山居群确实很特殊（如后翅基部较大范围明显的黑色斑块，体毛为灰白色），且和嵩山或泰山等高纬度地区的居群极为相似。推测这有可能受其寄主植物及采蝶时（2013年4月29日）当年的气候影响，因为不同气候（如阴雨、干旱、季节变化等）、寄主植物均影响蝶类个体发生和发育[12，14-17]。

研究冰清绢蝶寄主植物和气象的相关資料，结果表明，延胡索是琅琊山冰清绢蝶的唯一寄主植物，且大都分布在琅琊山寺附近高海拔地区（海拔200～300 m），蝶类对寄主植物专一性较强，虽然它们有一定的迁飞能力，但其分布仍然以寄主为中心[12-13，18-19]。据文献记载，延胡索琅琊山居群的6种主要异喹啉生物碱含量在河南、安徽、浙江、江苏、江西等12个居群中大都高于其他居群，尤其是紫堇碱含量最高（0.44%），比含量最低的江西宜兴大滩岭居群（0.024%）高达近20倍，又因延胡索对环境要求很严，对于低洼易积水及水分较少的干旱地段均不适合延胡索的生长，其生长期仅有3个月，一般分布在海拔200～800 m的丘陵山区的半阴坡，系早春植物[20]；同时，安徽滁州气象站提供气象资料和中央气象局数据库数据显示，琅琊山地区2013年3、4月降水量均为18.4 mm，与近30年同期均值相比，偏少7成；日照均为240 h，与常年相比偏多4成，整体气候近为春旱，冰清绢蝶与其寄主植物休戚相关。所以，琅琊山居群独特的翅脉形态特征可能与其寄主植物和当地的气候条件等都有密切关系。

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