不同氮效率基因型玉米物质积累及氮代谢相关酶活性的差异

黄伟超 范宇博 顾万荣

摘要 [目的]研究在不同氮素水平条件下，不同氮效率玉米品种的物质积累及氮代谢相关酶活性的差异。[方法]采用水培方式，选用氮高效玉米品种郑单958和氮低效玉米品种鑫鑫1号为供试品种，设置5个施氮浓度（N1～N5），分别为0.04、0.80、2.00、4.00和8.00 mmol/L，揭示不同品种氮效率差异的生理机制。[结果]随着施氮量增加，玉米幼苗的干物质积累不断升高，叶面积、总根长、根表面积和根体积逐渐增加，当施氮量为4.00 mmol/L（N4）时，以上指标达到最大。2个品种相比，氮高效品种郑单958效果好于鑫鑫1号。施氮量为8.00 mmol/L（N5）时株高最高。随着施氮量增加，硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）活性逐渐升高，但N3、N4和N5 这3个处理相同品种的酶活性增加幅度较小。谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性先上升后下降，N3处理时，2个品种活性最高。[结论]氮高效品种郑单958在不同的氮水平下有较高的氮代谢酶活性，这有利于氮肥的转化吸收和利用，从而有利于植株生长和物质积累。

关键词 玉米；物质积累；氮效率；氮代谢酶

中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0022-05

Abstract [Objective]To research the difference of dry matter accumulation and nitrogen metabolism enzyme activity of different nitrogen efficiency maize varieties in different nitrogen levels.[Method]Hydroponics was used in the research，high efficient nitrogen fertilizer cultivar （Zhengdan 958） and low efficient nitrogen fertilizer cultivar（Xinxin 1） were selected in the research and five nitrogen levels （N1～N5） were set（0.04，0.80，2.00，4.00 and 8.00 mmol/L）to uncover the physiological mechanism of different nitrogen efficiency in different maize varieties.[Result]With the increase of nitrogen application，dry weight accumulation was increased continuously and leaf area，total root length，root area and root volume were increased.The maximum value appeared in 4.00 mmol/L （N4）.Compared to Xinxin 1，Zhengdan 958 was better in above indicators.The biggest leaf area appeared in 8.00 mmol/L （N5）.With the increase of nitrogen application，NR and NiR activity were increased.The enzyme activity of same variety was less increase in N3，N4 and N5 treatments.GOGAT and GS activity showed first rising and then declining trend，and the highest activity of three varieties appeared in N3 treatment.[Conclusion] Zhengdan 958 shows higher nitrogen metabolism enzyme activity in different nitrogen efficiency maize varieties of different nitrogen levels，which is good for absorption，transformation and utilization of nitrogen as well as growth and matter accumulation of maize.

Key words Maize；Matter accumulation；Nitrogen use efficiency；Nitrogen metabolism enzyme

我國是玉米产量和播种面积仅次于美国的第二玉米生产国[1]。近些年，我国玉米种植面积迅速扩大，在2008年位居第一，超过水稻种植面积。玉米是具有多种用途的作物，可作为粮食、饲料、能源等。在农业生产中，玉米的地位越来越高，此外由于经济发展等原因，玉米的需求量在我国持续增加，据估算，到2030年玉米单产至少增加30%～40%[2]。提高玉米总产量，保证粮食安全的重要途径是实现玉米高产和超高产（≥12 000 kg/hm2）[3]。

在作物生产中，氮素有十分重要的作用。它是作物生长发育不可缺少的大量元素之一，也是作物提质增产的重要元素。世界氮肥的平均利用率为50%，而我国氮肥的平均利用率仅为30%左右，远低于世界平均水平[4]。我国每年因此原因损失的氮素约1 000万t，这使得氮素资源严重流失，并且给生态环境造成威胁[5]。因此，当前农业生产面临的重要问题是如何提高氮肥利用效率，减少氮肥用量。

近些年，玉米的氮效率问题引起了许多科技工作者的重视，并做了大量工作。但由于玉米氮肥利用率受施氮时期与施氮量等因素的综合影响，玉米的氮效率研究仍具有一定难度。目前对玉米氮代谢的研究主要集中在氮素对玉米生长发育以及产量的影响上，对于玉米氮效率基因型差异的生理生化基础、选择评价指标和改良途径等方面的研究还很少，因此玉米氮效率差异的研究对保持玉米的持续高产高效生产仍有重大意义。在前人研究的基础上，该试验选用氮效率不同的2个品种，研究不同氮素水平下2个品种在物质积累和氮代谢关键酶活性上的差异，从而揭示氮利用效率与氮代谢关键酶活性间的关系，为不同氮效率的玉米在生理层面上的差异研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 供试品种为郑单958（氮高效型）、鑫鑫1号（氮低效型）。

1.2 试验设计 试验于2016年在东北农业大学农学院实验室进行。水培试验播种前将挑选好的种子在恒温25 ℃下浸泡24 h，依据玉米田间生长的时期，将种子播种在放有蛭石的直径为0.5 m、深度为7 cm的圆盘中，每盘80粒种子，之后在种子上覆蛭石2～3 cm，每天视情况浇水。出苗后移入生长室内，待长到2叶1心时，精选生长整齐的幼苗，去掉胚乳后，移入装有1 L 1/2浓度营养液的桶中，每桶20株幼苗，营养液pH为6.1，3 d后换成完全营养液，前14 d每隔2 d更换1次营养液，之后每天进行更换。幼苗生长在昼夜温度为26 ℃/18 ℃的生长室中，光照强度为300 μmol/（m2·S）。转入营养液中生长20 d后的09：00取样测定。取整株幼苗保存待测形态及干重指标，取由上至下的第2片全展叶，用锡纸包样，-80 ℃保存待测生理及酶活指标。

营养液组成为CaCl2（2 mmol/L），K2SO4（0.75 mmol/L），KCl（0.1 mmol/L），KH2PO4（0.25 mmol/L），EDTA-Fe（0.15 mmol/L），H3BO3（1.0×10-3 mmol/L），MnSO4·H2O（1.0×10-3 mmol/L），ZnSO4·7H2O（1.0×10-3 mmol/L），CuSO4·5H2O（1.0×10-4 mmol/L），（NH4）6MO7O24·4H2O（5.0×10-6 mmol/L）。氮以Ca（NO3）2形态供给，向营养液中加入一定质量的Ca（NO3）2，使其在营养液中分别达到5个N水平（N1～N5），即0.04、0.80、2.00、4.00和8.00 mmol/L，并以2 mmol/L的CaCl2补充不足的Ca2+。每个N水平为1个处理，共5个处理，每个处理20株幼苗。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 株高。随机选取5株植株，用刻度为1 mm的直尺测量从幼苗底部到自然垂直的最高点距离，求5株平均值。

1.3.2 叶面积。采用SHY-150型便携式叶面积仪测定。

1.3.3 根系扫描。

采用加拿大Regent公司生产的根系扫描仪，经数字化软件（WinRHIZO-2004a）分析后获得根系形态数据。

1.3.4 幼苗干重。

随机选择5株幼苗，将幼苗放入铁盘内，放入烘箱105 ℃杀青30 min，之后80 ℃烘干至恒重，称重为幼苗干重。

1.3.5 根冠比。

根冠比=地下部干重/地上部干重。

1.3.6 硝酸还原酶（NR）活性测定。取样品约0.5 g，分别装入50 mL锥形瓶中（对照加1 mL 20%的三氯乙酸），加入5%乙酸乙酯50 μL。内源和外源基质下的锥形瓶中各加入9 mL pH=7.5的35 mmol/L的磷酸缓冲溶液，再加入25 mmol/L的KNO3在外源条件下的锥形瓶中。反复抽真空，之后将三角瓶放置在25 ℃黑暗中保温30 min，取出后将1 mL 20%三氯乙酸加入测试管中终止反应。将2 mL反应液加入2 mL 1%磺胺、2 mL 0.02% α-萘基乙烯二胺盐酸，室温下静置20 min显色，540 nm处比色记录吸光值。

1.3.7 谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定。

取1 g样品研磨，之后每一样品中加入2 mL咪唑-盐酸（0.05 mmol/L）提取缓冲液，研磨成均匀的黏糊状后，静置30 min，12 000 r/min离心20 min，取上清液用于酶活性测定，调节pH至7.2，以上提取过程均保持在4 ℃下进行。

GS的测定：依次取1 mL咪唑-盐酸缓冲液、0.2 mL的0.5 mol/L MgCl2·6H2O、0.2 mL的50 mmol/L EDTA-Na2、0.2 mL的1.00 mol/L Glu-Na2、0.2 mL的0.498 mol/L盐酸羟胺和0.2 mL的180 mmol/L ATP-Na2放入试管中，再迅速加入1 mL粗酶液混匀，于30 ℃水浴上反应15 min，然后立即取出，加入1 mL终止显色液（0.37 mol/L FeCl3、0.67 mol/L三氯乙酸、0.2 mol/L HCl）终止反应，在5 000 r/min下离心10 min，取上清液测540 nm处吸光值。

1.3.8 亚硝酸还原酶（NiR）活性测定。

将1 g 叶片（或根）样品于3 mL 提取液（内含50 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl、5 mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EDTA）研钵中研磨，匀浆于14 000 r/min下离心20 min，上清液用于活性测定，以上过程均在4 ℃环境下进行。反应体系包含 50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、0.5 mmol/L NaNO2和1 mmol/L 甲基紫精（methyl viologen，MV），加50 μL提取液定容到0.9 mL。加入100 μL溶于0.2 mol/L NaHCO3溶液中的0.12 mol/L Na2S2O4（連二亚硫酸钠），30 ℃水浴60 min，开始反应。然后通过剧烈涡旋直到甲基紫精的颜色完全褪去终止反应。再加入100 μL 1 mol/L Zn（CH3COO）2，于14 000 r/min下离心10 min。上清液中NO2-残留量测定，通过吸取500 μL上清液加入250 μL 1% 磺胺储备液（内含1.5 mol/L HCl）和250 μL 0.02% α-萘基乙烯二胺盐酸，540 nm下测定残留于上清液中的NO2-吸光值，计算NO2-消耗量，每一处理3次重复，并设1个对照，对照在反应进行前先加1%磺胺和0.02% α-萘基乙烯二胺盐酸，其余步骤与测试管相同。

1.3.9 谷氨酸合成酶（GOGAT）活性测定。

取1 g叶或块根，使用预冷的研钵和研杵，加入2 mL 酶提取缓冲液[100 mmol/L KH2PO4， pH 7.5，0.5 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），100 mmol/L KCl，0.5%（v/v）Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），0.1%（v/v）巯基乙醇]、1 g 石英砂和0.3 g Dowex 1，1X2-400（平衡提取缓冲液）干冰上进行研磨。然后再加入4 mL 提取缓冲液（调节提取液pH 为7.4～7.7），4 ℃ 20 000 r/min 下离心 20 min，采用凝胶过滤法，取2 mL 上清液，使用前用反应缓冲液（500 mmol/L KH2PO4/KOH，pH 7.5，0.1% （v/v）巯基乙醇平衡的4 cm/4 mL Sephadex G-25除去低分子量物质，上清液可直接用于酶活性测定。

1.4 数据分析工具

试验数据用平均值表示，采用DPS进行方差分析，Duncans新复极差法进行多重比较（α=0.05），Microsoft Excel 2010软件作图。

2 结果与分析

2.1 氮水平对不同基因型玉米干重的影响

由表1可知，随着氮水平的升高，2个品种地上部分干重呈先上升后下降的趋势，2个品种均在N4水平时，地上部分干重最大，N5水平時地上部分干重下降，但郑单958的N4处理与N5处理差异不显著，而鑫鑫1号差异显著。这表明在极高氮水平下，鑫鑫1号对多余氮的利用和转化能力弱于郑单958，且地上部分干重受不良影响较大。当供氮水平由N1升高到N2时，郑单958的地上部分干重有明显的升高，升高幅度为35.34%，鑫鑫1号的增加幅度为11.86%，但差异不显著。2个品种相比，郑单958地上部分干重在每一个供氮水平下都高于鑫鑫1号，且差异显著。

2个玉米品种根系干重的趋势与地上部分干重趋势相同，即随着氮水平的升高，根系干重逐渐升高，N4水平时达到最大，之后下降。郑单958和鑫鑫1号的N4处理与N5处理间均差异显著，N5处理较N4处理根系干重分别下降了8.51%和11.11%。这表明氮供应过量的条件下，鑫鑫1号的根系干重受到的不良影响大于郑单958，鑫鑫1号对多余氮的利用和转化能力较郑单958差。当供氮水平由N1升高到N4时，郑单958根系干重升高37.40%，鑫鑫1号升高55.17%，均差异显著。这表明，最佳的供氮水平对于氮低效品种根系干重的增加更为重要。

随着氮水平的提高，总干重同样呈现先升后降的趋势，2个玉米品种均在N4水平时总干重最大。2个品种的根冠比随着氮水平的升高出现不同的趋势，郑单958根冠比一直呈下降的趋势，这表明氮水平升高能促进郑单958的地上部分生长。当氮水平由N1升高到N2时，鑫鑫1号的根冠比升高，氮水平为N2～N4时，根冠比降低，N4～N5时根冠比升高。这表明氮水平极高或者极低不利于鑫鑫1号地上部分干重积累。不同氮水平对郑单958地上部分干重积累的促进作用大于根系干重的积累，而对鑫鑫1号的影响则是根据氮水平的不同而出现差异。

2.2 氮水平对不同基因型玉米叶面积的影响

由图1可知，在不同的氮水平下，2个玉米品种叶面积的变化规律为随着氮水平的升高，叶面积呈上升的趋势，N4水平时叶面积最大，N5水平时叶面积下降。与N1相比，郑单958的N4处理叶面积增加了71.36%，鑫鑫1号的叶面积增加了47.53%。氮水平由N1升高到N4时，郑单958叶面积增加量高于鑫鑫1号，这表明郑单958对氮吸收同化的效果好于鑫鑫1号。当氮水平由N4升高到N5时，郑单958叶面积下降了7.84%，差异不显著，鑫鑫1号叶面积下降了12%，差异显著。这表明，郑单958比鑫鑫1号有更好的耐氮能力。

2.3 氮水平对不同基因型玉米株高的影响

氮素具有促进作物生长的作用，缺氮时植株表现为生长缓慢，植株矮小。从图2可以看出，随氮水平的提高，株高总体表现为增加的趋势，但氮素供应水平超过N3后，株高增加缓慢。不同氮效率基因型株高的规律为郑单958大于鑫鑫1号，不同氮效率基因型之间的株高差异达到显著水平。

2.4 氮水平对不同基因型玉米根长的影响

由图3可知，随着氮水平的提高，2个玉米品种的根长呈先升高后下降的趋势，在N4水平时根长最大。与N1处理相比，郑单958和鑫鑫1号的N4处理根长分别增加了81.02%和58.07%，且差异显著。这表明，郑单958对氮吸收效率更高，施用氮肥时，对根长生长的促进作用大于鑫鑫1号。郑单958根长为N1～N4处理时，均有显著升高，鑫鑫1号根长在N1～N3处理时有明显增加。当氮水平由N4升高到N5时，郑单958根长没有明显的下降，而鑫鑫1号根长出现明显下降，分别下降了5.75%和9.56%。

2.5 氮水平对不同基因型玉米根表面积的影响 由图4可知，随着氮水平的提高，根系表面积呈先升高后降低的趋势，在N4水平时2个品种的根系表面积达到最大。与N1相比，郑单958的N4处理根表面积升高了83.44%，鑫鑫1号升高了66.35%，在一定供氮水平范围，郑单958的氮吸收转化能力好于鑫鑫1号。

2.6 氮水平对不同基因型玉米根体积的影响

由图5可知，随着氮水平的不断升高，2个玉米品种的根体积呈先升后降的趋势，在N4水平时根体积达到最大，之后下降。与N1水平相比，郑单958的N4水平根体积增加了67.03%，鑫鑫1号增加了47.76%。郑单958在N1、N2和N3水平下根体积快速增长，3个氮水平的根体积间差异显著，当氮水平到N4时，根体积增长缓慢，且与N3水平差异不显著。鑫鑫1号在N1和N2的氮水平下根体积快速增长，且差异显著，N3和N4水平根体积增加缓慢。

2.7 氮水平对不同基因型玉米叶片硝酸还原酶（NR）活性的影响

硝酸还原酶在氮代谢中的作用是将NO3-转换成NO2-，供植株进一步使用。如图6所示，随着氮水平的增加，2个品种出现了不同的变化规律，郑单958的NR活性持续上升，最高活性出现在N5水平时，与N1处理相比，N5的酶活性升高了64.24%。鑫鑫1号的NR活性先升高后降低，在N4处理时达到最大，N5时酶活性降低，与N1相比，N4的活性升高了18.72%。

2.8 氮水平对不同基因型玉米叶片亚硝酸还原酶（NiR）活性的影响

NiR在氮代谢中的作用主要是将NO2-转换成为NH4+，从而进一步被植物使用。由图7可知，郑单958的NiR活性随着氮水平的升高呈上升的趋势，在N1～N2时，NiR活性呈快速上升的趋势，N2～N5时，活性升高缓慢，且N3、N4和N5三者之间差异不显著。鑫鑫1号的NiR活性在N1～N2水平时呈现快速升高趋势，之后NiR的活性几乎不变，在N5的供氮水平时活性下降。当氮水平由N1升高到N2时，郑单958的NiR活性升高了139.95%，鑫鑫1号升高了191.96%。

2.9 氮水平对不同基因型玉米叶片谷氨酸合成酶（GOGAT）活性的影响

谷氨酸合成酶（GOGAT）是氮代谢过程中重要的酶，它在谷氨酸的合成循环中主要是催化谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成谷氨酸。由图8可知，隨着供氮水平的升高，2个玉米品种的GOGAT活性呈现先升后降的趋势，在N3水平时，GOGAT活性最高。与N1相比，郑单958的N3水平的GOGAT活性升高了47.83%，鑫鑫1号升高了48.94%。

2.10 氮水平对不同基因型玉米叶片谷氨酰胺合成酶（GS）活性的影响

谷氨酰胺合成酶（GS）是植物氮代谢的关键酶，它在谷氨酸合成循环中催化谷氨酸与NH3形成谷氨酰胺，参与植物含氮化合物的新陈代谢。由图9可知，随着供氮水平的提高，2个品种的GS活性呈现先升后降的趋势，在N3水平的氮供应量上，2个玉米品种的GS活性达到最大，之后下降。与N1处理相比，郑单958 N3处理的GS活性升高了60.01%，鑫鑫1号升高了57.32%。

3 讨论

3.1 不同氮素水平对玉米幼苗物质积累的影响

氮是植物生长发育所必需养分，是植物体内许多重要有机化合物如酶、氨基酸、核酸、部分激素的组成成分之一[6]。适量的氮素供应可增强植物有机物质的合成，该试验中，氮素促进植物生长，且叶面积的增加进一步促进了光合同化物的合成。该研究中，在一定的范围内，随氮素供应量的增加，幼苗的株高、叶面积、生物量（植株干重）也不断增加，进一步增加氮素供应量，其对植株地上部生长的促进作用逐渐变小。根系是植物吸收水分和养料的器官，且是植物适应环境的重要器官之一，大多数生活在土里，构成植物的地下部分[7]。LADHA等[8]研究认为，氮素高效吸收型水稻通过发育较好的根系形态来提高其对氮素的吸收和利用能力。该研究中，随着氮素浓度的增加，供试品种的根总长、根表面积和根体积总体呈先升后降的趋势，表明低浓度的氮素供应可以促进根系的生长，进而增强根系对养分的吸收和利用能力，氮素浓度继续升高对根系形态的影响较小，这与姜琳琳等[9]对玉米的研究结果一致。低量供氮时玉米根系主要通过伸长变纤细来增加根系对氮素的接触面积，在适量供氮时玉米根系变粗，体积增加。

3.2 不同氮素水平对玉米幼苗叶片氮代谢相关酶活性的影响

硝态氮是植物重要的氮来源，硝态氮进入植物体后需要还原为氨态氮，才能进一步合成氨基酸和蛋白质。NR是氮素同化的起始酶和限速酶，NiR是控制酶，二者活性与植物同化NO3-的能力密切相关，直接影响植物对无机氮的利用[10-13]。在甜菜及小麦中的研究表明，NR、NiR活性随着硝态氮水平的增加而提高，而该试验中，NR和 NiR活性随着硝态氮水平的增加而提高，说明NO3-增加能诱导叶片的 NR和NiR活性升高，进而为合成氨基酸和形成蛋白质提供较充足的氨，但当氮浓度超过一定水平时，氮低效品种鑫鑫1号的NR和NiR活性下降，可能是因为NO3- 浓度过高而对植物产生毒害所致。在适氮水平，NR和NiR活性在品种间存在差异：郑单958的NR和NiR活性高于鑫鑫1号，说明NR和NiR活性大小除受氮素供应量的影响外，还受品种本身遗传特性的影响。

植物体内氮素的同化与再利用的关键酶是谷氨酰胺合成酶（GS），它是氮代谢系统中心的有多种功能的酶，许多氮代谢的调节都有GS 的参与，植物对氮素同化能力的高低可用GS 活性来衡量。在氨的同化过程中，GS有着中心作用，其具有2种酶的活性：合成酶和转化酶，植物氨同化和氮素转运与GS活性密切相关。在同化NH4+时，GS和GOGAT同时起作用，形成GS/GOGAT 循环。GS/GOGAT循环是植物NH4+代谢的主要同化途径，占氨同化的95%以上[14-18]。该试验中，GS、GOGAT活性随氮素施用量的增加呈现先上升后下降的趋势，这表明氨同化过程受氮供应水平的影响。

4 结论

随着施氮量增加，玉米幼苗的干物质积累不断升高，叶面积、总根长、根表面积和根体积逐渐增加，当施氮量为4.00 mmol/L（N4）时，以上指标达到最大。2个品种相比，氮高效品种郑单958效果好于鑫鑫1号。施氮量为8.00 mmol/L（N5）时株高最高。随着施氮量增加，硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）活性逐渐升高，但N3、N4和N5这3个处理相同品种的酶活性增加幅度较小。谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性先上升后下降，N3处理时，2个品种活性最高。氮高效品种郑单958在不同的氮水平下有较高的氮代谢酶活性，这有利于氮肥的转化吸收和利用，从而有利于植株生长和物质积累。

参考文献