糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞凋亡相关蛋白Bcl—2与Bax的表达与意义

张闻达

摘要：目的 观察Bcl-2与Bax在糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞中的变化，探讨其在糖尿病胃轻瘫发生中的意义。方法 成年SD大鼠20只，链脲佐菌素（STZ）诱导制备糖尿病大鼠模型，另取20只作为正常对照组，饲养6 w后处死取胃组织。利用免疫组织化学染色检测胃平滑肌组织Bcl-2与Bax的表达。结果 正常对照组Bcl-2显色指数（5.68±3.24）；糖尿病组Bcl-2显色指数（1.58±0.72）；两组比较有明显差异P<0.01。而Bax在正常对照组显色指数（1.74±0.75）；在糖尿病组显色指数（5.75±2.12），两组比较有明显差异P<0.01。结论 Bcl-2 与Bax表达的变化可能在糖尿病胃轻瘫的发生中发挥重要作用。

关键词：糖尿病；胃轻瘫；Bcl-2；Bax；表达

中图分类号：R587.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）13-0083-02

Abstract：Objective To observe the changes of Bcl-2 and Bax in gastric smooth muscle cells of diabetic gastroparesis rats，and to explore the significance of Bcl-2 and Bax in the pathogenesis of diabetic gastroparesis.Methods 20 adult SD rats， streptozotocin（STZ）induced by preparation of diabetic rat model，another 20 rats as normal control group，feeding 6 w were obtained by the expression of gastric tissue.Immunohistochemical staining of Bcl-2 and Bax in gastric smooth muscle tissue.Results The normal control group Bcl-2 color index（5.68±3.24）；diabetes mellitus group Bcl-2 color index（1.58±0.72）；there was significant difference between the two groups，P<0.01.But Bax in the normal control group the color index（1.74±0.75）；In diabetic group，the color rendering index（5.75±2.12）was significantly different between the two groups.P<0.01.Conclusion Bcl-2 and Bax expression may play an important role in the development of diabetic gastroparesis.

Key words：Diabetes mellitus；Gastroparesis；Bcl-2；Bax；Expression

胃轻瘫是糖尿病常见的慢性并发症之一，主要表现为胃动力低下、胃排空延迟、胃转运时间延长等引起的腹胀、恶心、呕吐等。至今糖尿病所致胃轻瘫的机理仍不完全清楚[1]。Bcl-2与Bax共属于一个家族，通过控制线粒体膜的通透性来调节凋亡激活物。bax二聚体在膜上打开通道，增加通透性；bcl-2與bax形成异聚体，降低通透性。所以，bcl-2水平的升高和bax的降低表明细胞对凋亡的抵抗性增强，应该是保护药物起作用的标志；而反之则相反。研究发现，糖尿病大鼠成模6 w后出现胃轻瘫机体症状，并发生胃平滑肌细胞凋亡[2]。为探讨Bcl-2与Bax在糖尿病胃轻瘫中的变化及作用，本实验以糖尿病胃轻瘫模型大鼠为研究对象，观察了胃平滑肌细胞的Bcl-2与Bax蛋白与基因的表达，旨在进一步阐明糖尿病胃轻瘫的发生机制，为临床探索新的治疗方案提供科学的理论依据与实验依据。

1 材料与方法

1 材料与试剂

成年SD雄性大鼠40只，雌雄不限，体重200～220 g，由延边大学实验动物中心提供。链脲佐菌素（STZ）（SIGMA），Bcl-2、Bax抗体（Cell Signaling），即用型SABC免疫组化试剂盒（博士德），小量柱离心式组织总RNA提取纯化试剂盒（华舜）；PremixTaqR TaqTMVersion（宝生物）；Wizard〗〗（#A7170）纯化试剂盒（Promega）；一步法RT-PCR试剂盒（Promega）。

1.2方法

1.2.1模型制备与分组 实验分为模型组和正常对照组，每组20只。0.1 mol/L的柠檬酸盐缓冲液（pH4.0）配制成0.5%的STZ溶液；大鼠禁食不禁水12 h，称重；将STZ用0.1 mol/L的柠檬酸盐缓冲液（pH4.0）配制成0.5%的STZ溶液；糖尿病组大鼠一次性腹腔注射65 mg/Kg STZ，制备糖尿病大鼠模型。正常对照组一次性腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。给药1 w后，采尾部静脉血测定血糖浓度，血糖浓度高于350 mg/dl大鼠确定为造模成功。所有大鼠均单笼饲养，自由进食和饮水，于饲养6 w后处死用于实验。

1.2.2免疫组织化学法观察Bcl-2与Bax蛋白 采用S-P法检测两组实验大鼠为平滑肌Bcl-2与Bax的表达情况。双盲法选取实验用每张切片不同部位随机观察五个400倍视野，分别记录显色程度和显色范围。显色程度分弱+、中++、强+++表示。显色范围分：显色范围占高倍视野<1/4为+，占1/4～2/4为++，占2/4～3/4为+++，>3/4为++++。然后将每个高倍视野显色程度和范围换算成“显色指数”。显色指数=显色程度×显色范围（+，++，+++，++++分别按1，2，3，4分计算）。取均数为每一种类蛋白表达的最终显色指数。

1.3统计学处理

实验数据应用SPSS 16.5统计软件包进行统计分析。所有数据采用（x±s）表示，计量资料采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著的统计学意义。

2 结果

2.1两组大鼠胃平滑肌Bcl-2蛋白的表达

免疫组化法结果显示，正常对照组胃平滑肌细胞Bcl-2呈散在分布的棕色颗粒，显色指数（5.68±3.24）；糖尿病组胃平滑肌细胞Bcl-2未见明显棕色颗粒，显色指数（1.58±0.72）；两组比较有明显差异（P<0.01），见图1。

2.2两组大鼠胃平滑肌Bax蛋白的表达

免疫组化法结果：Bax在正常对照组胃平滑肌细胞未见明显棕色颗粒，显色指数为（1.74±0.75）；在糖尿病组胃平滑肌细胞Bax呈散在分布的棕色颗粒，显色指数（5.75±2.12），两组比较有明显差异（P<0.01），见图2。

3 讨论

糖尿病胃轻瘫的发生是一个复杂的病理生理过程。目前，关于糖尿病胃轻瘫发病机制的研究，主要集中在高血糖造成的神经性病变、胃激素分泌障碍、应激以及部分细胞第二信使的变化等方面，而关于细胞凋亡及其调控的研究，少见报道。细胞凋亡可以通过两种途径被介导：线粒体凋亡途径和死亡受体介导的途径。这其中细胞色素C的释放是一个十分重要的事件。许多学者认为线粒体细胞色素C的释放是通过通透性转变气孔，而Bcl-2家族蛋白直接调节PTP。在这些蛋白中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-Xl能够保存膜电位，阻断细胞色素C的释放；而Bax、Bcl-Xs、Bak、Bid和Bad是前凋亡蛋白，它们通过影响PTP而消除了线粒体的膜电位，促进细胞色素C的释放。细胞凋亡可受多种细胞因子诱导与调控。同一组织或细胞受不同因子的作用其反应结果不尽相同，同一细胞因子也可受不同的因子影响表现出不同的生物学效应[3]。Bcl-2 与Bax蛋白是上述凋亡调控蛋白中研究较多的蛋白。研究发现Bax/Bcl-2 两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，bax 是极重要的促细胞凋亡基因之一。

高血糖是糖尿病的特征性临床表现，也是糖尿病并发症发生的基础。它能够使细胞发生氧化应激和代谢障碍，造成缺氧、氨基酸水平降低、低ATP或AMP增多等。研究发现，细胞的上述变化可诱导细胞凋亡的发生[4]。为了探讨Bcl-2 与Bax在糖尿病胃轻瘫发生过程中的作用。本实验首先制备了糖尿病大鼠模型，并利用免疫组织化学染色法观察了Bcl-2 与Bax蛋白的表达，结果发现糖尿病状态下Bcl-2表达下降，而Bax表达升高[5]。结果表明，糖尿病状态下胃平滑肌细胞可能出现了细胞凋亡。同时这结果也表明，Bcl-2 与Bax参与糖尿病胃轻瘫的发生，并可能调控细胞凋亡。

参考文献：

[1]陈霞，赵宏贤，杨燕，等.糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞凋亡的线粒体信号转导通路研究[J].中国现代医学杂志，2010（18）：2736-2739.

[2]张默函，姜京植，蔡英兰，等.糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞凋亡与IGF-1 PI3K AKT信号通路的动态变化及意义[J].中国糖尿病杂志，2015，23（11）：1023-1026.

[3]Childs BG，Baker DJ，Kirkland JL，et al.Senescence and apoptosis： dueling or complementary cell fates[J].EMBO Rep，2014，15（11）：1139-1153.

[4]Sankari SL，Babu NA，Rajesh E，et al.Apoptosis in immune-mediated diseases[J].J Pharm Bioallied Sci，2015，7（Suppl 1）：S200-2.

[5]姚東英，刘菲.糖尿病胃轻瘫发病机制的研究进展[J].国际消化病杂志，2011，31（1）：16-17，47.

[6]胥建辉，侯晓钰，赵宏贤.糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道的变化[J].中国病理生理杂志，2015，31（7）：1288-1293.

[7]孙曼怡，刘燕，冯凭.糖尿病结肠动力障碍近端结肠平滑肌细胞相关凋亡基因表达的研究[J].天津医药，2011，39（5）：448-451.

编辑/王朵梅