正交试验法优选四黄定痛贴提取工艺

潘传波，郭剑华，郭亮，李卿，马善治，刘渝松，漆伟，刘才英，叶承莉，唐彦

（1.重庆市中医骨科医院，重庆400010；2.重庆市中药研究院，重庆400065）

·实验研究·

正交试验法优选四黄定痛贴提取工艺

潘传波1，郭剑华1，郭亮1，李卿2，马善治1，刘渝松1，漆伟1，刘才英1，叶承莉1，唐彦1

（1.重庆市中医骨科医院，重庆400010；2.重庆市中药研究院，重庆400065）

目的优化四黄定痛贴提取工艺。方法采用正交试验法，以盐酸小檗碱为指标，考察乙醇浓度、用量、提取时间、提取次数对提取工艺的影响。结果最佳提取工艺为8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60 min。结论优化的提取条件稳定可行，重复性好，适用于该制剂的工业化生产。

四黄定痛贴；正交试验；盐酸小檗碱；验证；提取工艺

痛风为人体内嘌呤代谢紊乱所致疾病，随着生活方式的改变，患病率呈逐年上升趋势，已成为一种常见病、多发病。痛风的病因主要有尿酸生成增多，排泄减少或含有易感基因3个方面，其中尿酸生成增多或排泄减少是原发性高尿酸血症的主要病因。痛风性关节炎的急性期表现为以关节红肿热痛为主，病及1个或多个关节，伴发热、舌红、苔黄、脉数，高尿酸血症是痛风性关节炎的主要致病原因。四黄定痛贴是我院全国名老中医传承工作室专家郭剑华主任中医师依据中医的辨证论治并结合临床实践，通过疗效观察，不断对处方优化组合和剂量的配比拟订的，由黄连、黄柏、独活、乳香、没药、细辛组方，具有散寒祛湿、通经止痛功效，主要用于急性痛风性关节炎。为使其质量稳定，便于携带和使用，将其改良为贴剂。由于处方药味含有生物碱类、黄酮类、树胶、环烯醚萜苷类等化合物，结合药理动物药效学筛选试验结果，拟采取药材乙醇回流提取法进行提取工艺研究。本试验中采用L9(34)正交试验，以盐酸小檗碱含量为测评指标，优化四黄定痛贴的提取工艺，为该制剂的规范化生产和临床疗效提供理论依据。

1 仪器与试药

2010A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；盐酸小檗碱对照品(批号为0713－9906，含量为98.14%，中国食品药品检定研究院)；药材购自重庆慧远药业有限公司，经重庆市中药研究院肖铭玉副研究员鉴定，均符合2015年版《中国药典(一部)》收载品种；乙腈、磷酸为色谱纯；水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

色谱柱：迪马－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈－0.03 moL/L磷酸二氢钠－磷酸（28∶72∶0.08）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：265 nm。

2.1.2 溶液制备

对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品6.24 mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。精密吸取对照品贮备溶液5.0m L，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液：照处方比例称取药材，按正交试验进行提取，滤过，合并滤液，浓缩至适量，加乙醇定容至500m L，摇匀。精密量取1.0mL，置25m L容量瓶中，加甲醇适量，超声处理15min，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

缺黄连、黄柏的阴性对照品溶液：取不含黄柏的阴性样品适量，照供试品溶液制备方法制备，得阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性考察：精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μL，进样测定。供试品溶液色谱中，在与对照品色谱相同保留时间有相应色谱峰，阴性对照品溶液色谱无相应色谱峰，表明阴性对照无干扰，目标峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5。色谱图见图1。

鉴于此，飞灰的固化稳定化技术成为国内外机构广泛研究的课题。目前，常用的固化方法有水泥固化法、熔融固化法和药剂固化法等。药剂固化法是利用化学药剂通过化学反应使有毒有害物质转变为低溶解性、低迁移性及低毒性物质的过程。药剂固化法流程如图1所示。

线性关系考察：按测订色谱条件，分别精密吸取对照品溶液2，4，8，10，16，20μL，进样测定盐酸小檗碱峰面积。以盐酸小檗碱进样量（C）为横坐标，以相对应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程A＝2 084 472C－156 288.5，r＝0.999 9(n＝6)。结果表明，盐酸小檗碱进样量在0.024 496～0.244 96μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10μL，连续进样6次，测定。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.58%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液10μL，按拟订色谱条件分别于0，1，4，8，12 h时进样测定。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.72%（n＝6），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批样品6份，依法制备供试品溶液，进样测定，记录盐酸小檗碱峰面积，计算样品中盐酸小檗碱含量。结果样品中盐酸小檗碱含量为4.66%，RSD为1.04%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的同批样品6份（盐酸小檗碱含量为4.66%），分别加入不同浓度的盐酸小檗碱对照品溶液适量，依法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果盐酸小檗碱平均回收率为98.31%，RSD为0.84%（n＝6），详见表1。

1.盐酸小檗碱A.对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图1高效液相色谱图

2.2 正交试验

2.2.1 因素水平

以提取液中的盐酸小檗碱为考察指标，采用L9(34)正交试验对乙醇浓度（因素A）、乙醇量（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）进行试验。因素水平见表2。

表1 盐酸小檗碱加样回收试验结果(n＝6)

表2 L9(34)正交试验因素水平表

2.2.2 正交试验结果与方差分析

试验设计及结果见表3和表4。可见，各因素对提取效果均有影响，影响小檗碱提取因素中(C＞A＞B＞D)，最佳提取工艺为A2B2C3D1，即用8倍量60%乙醇，回流提取1次，提取60min。方差分析表明，C因素对试验结果有显著影响，A，B因素有一定影响，D因素无甚影响。从生产实际角度考虑，选择用8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60min，即可。

表3 L9(34)正交试验结果

表4 方差分析结果

2.2.3 提取工艺的验证试验

按处方比例称取药材，采用拟采用工艺条件提取，照正交试验项下色谱条件测定盐酸小檗碱含量。第1次小檗碱含量为4.67%，第2次为4.67%，第3次为4.66%。可见，正交试验最优提取工艺中，综合考虑，小檗碱含量较高，可作为四黄定痛贴的提取方法，即用8倍量60%乙醇，回流提取3次，每次60min，即可。

3 讨论

3.1 提取溶剂选择[1－4]

本处方中含黄连、黄柏、乳香、没药等多味药材。其中，黄连、黄柏含生物碱成分，主要为小檗碱；栀子主要包括环烯醚萜苷类、二萜类(西红花苷类)、有机酸酯类及其他类化合物；独活根含白芷素、虎耳草素、佛手柑内酯、花椒毒素、牛防风素、异虎耳草素、异佛手柑内酯等多种呋喃香豆精类；乳香含大环二萜、四环三萜及五环三萜等多种挥发油类化学成分；没药含树脂、挥发油、树胶。提取工艺预试验曾考察水提取法、乙醇提取法，并比较盐酸小檗碱含量和处方浸得收率，结果表明，采用乙醇提取法盐酸小檗碱含量较高，而处方浸膏得率相对较少，结合本处方前期药理动物试验和药效学试验结果，本处方提取工艺选用乙醇提取。

3.2 提取方法考选择5－7]

渗漉法和热回流提取法为乙醇提取的常用方法，该提取方法的考察以盐酸小檗碱为检测指标，试验结果表明，渗漉提取法中盐酸小檗碱含量与热回流提取法中小檗碱含量基本接近，由于采用渗漉法提取需将药材粉碎为一定细度，且生产过程需较长时间，从工业化大生产角度考虑，采用热回流提取法操作更简单，生产效率更高。故选用乙醇回流法作为提取方法。

3.3 检测指标选择[8－9]

黄连药材及以黄连药材入药的中药成方制剂中，其提取工艺常用单一成分作为考察指标，而黄连药材中还含有其他多种生物碱类成分，如盐酸药根碱等；以黄连入药的中药成方制剂中由于成分更复杂，考虑的因素更多。结合文献报道，以盐酸小檗碱作为单一检测指标考察黄连药材及其入药的中药成方制剂，与采用多成分、多指标进行综合评价，其所得优化提取工艺基本一致。故本试验采用单一的盐酸小檗碱含量作为优化提取工艺的检测指标，正交试验结果表明，方法简单可行，易于操作。

3.4 色谱条件选择[10－17]

方法，测定盐酸小檗碱液相色谱条件，多以离子对试剂作为流动相，离子对试剂对色谱柱及色谱仪影响较大。本试验中同时测定盐酸小檗碱的含量，经优化色谱条件，选用乙腈－0.03moL/L磷酸二氢钠（含0.08%磷酸）为流动相，方法简单，实用可行，基线平稳，峰形对称，目标峰与相邻峰分离度良好，能用于测定制剂中盐酸小檗碱含量。

综上所述，该中药复方制剂是由黄连、黄柏、独活等多味药材组方，为便于携带，将原来的汤剂制为贴剂，保持了原方疗效。采用乙醇提取法进行制备，通过L9(34)正交试验法优化工艺参数，确定各项工艺条件，工艺稳定可行，可用于工业化大生产。

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Extraction Technology Op tim ization of Sihuang Dingtong Patch by O rthogonal Test

Pan Chuanbo1,Guo Jianhua1,Guo Liang1,Li Qing2,Ma Shanzhi1,Liu Yusong1,Qi Wei1,Liu Caiying1,Ye Chengli1,Tang Yan1
(1.Chongqing traditional Chinese medicine orthopaedics hospital,Chongqing,China 400010; 2.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing,China 400065)

Objective To optimize the extraction technology of Sihuang Dingtong Patch.M ethods The orthogonal test was performed to investigate the effects of ethanol concentration,ethanol amount,extraction times and extraction time on the extraction results with the content of berberine hydrochloride as the evaluation index.Resu lts The best optimum conditions were as follows:the amount of ethanol 8 times,60%was used as the extraction solvent,extraction times 3 times and the extraction duration for each time was 60 min.Conclusion The optimized extraction technology of Sihuang Dingtong Patch is stable,feasible and reproducible,which can apply to the production of Sihuang Dingtong Patch.

Sihuang Dingtong Patch;orthogonal test;berberine hydrochloride;verification;extraction technology

TQ460.6

A

1006－4931(2017)09－0013－04

2017－01－10；

2017－02－18)

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.09.004

重庆市卫生和计生委中医药科技项目[ZY20150227]。

潘传波，男，硕士研究生，副主任医师，研究方向为公共卫生服务与卫生事业管理，（电话）023－63930833（电子信箱）panchbo＠tom.com。