山羊子宫内膜细胞的体外培养技术及其应用研究进展

张艳艳 匡世军

摘要 对目前现有的山羊子宫内膜细胞的体外培养技术及其应用的研究进展进行了综述，旨在为该技术在山羊上的进一步应用提供参考。

关键词 山羊；子宫内膜细胞；体外培养；应用

中图分类号 S827 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0102-02

Research Progress on the Culture Technologies of Endometrial Cells of Goat in vitro and Their Application

ZHANG Yan-yan1， KUANG Shi-jun2 （1.Department of Pharmaceutical Science and Technology，Heze University， Heze，Shandong 274015； 2. Chongqing Kaizhou Vocational Education Center， Chongqing 405400）

Abstract The research progress on current culture techniques of goat′s endometrial cells in vitro and their applications were reviewed，so as to provide references for further application of this technique in goat.

Key words Goat；Endometrial cells；Culture in vitro；Application

子宮是雌性动物孕育胎儿、繁殖后代的场所，受多种激素的调节，同时也是一个重要的内分泌器官，能分泌包括激素、酶类和免疫因子在内的多种功能性物质。这些物质不仅调节子宫本身的功能状态和生殖平衡，在整个机体的生理协调方面也发挥着极其重要的作用[1]。子宫内膜位于子宫壁最里层的子宫腔面，由上皮层和其下的固有层构成；上皮层主要是由具有分泌功能的子宫内膜上皮细胞组成，而固有层则主要是由子宫内膜基质细胞组成；此外，子宫内膜还含有少量的表皮细胞、血管平滑肌细胞和炎性细胞等[2]。因此，子宫内膜细胞的培养就是对子宫内膜上皮细胞和基质细胞的培养。子宫内膜在研究机体生殖生理方面具有重要地位[3]。子宫内膜上皮细胞和基质细胞都是性腺激素的靶细胞，在雌孕激素的调节下发生一系列变化，为胚胎着床做准备。这种变化不仅包括细胞形态的改变，而且包括细胞增殖和分泌功能的变化，分泌的各种影响因子能促进胚胎着床和维持妊娠[4]。

在体状态下研究子宫内膜容易受到机体其他因素的影响，而体外培养细胞不仅可以排除这些干扰，而且能直接对细胞进行观察和处理。因此，体外培养的子宫内膜细胞成为研究子宫内膜细胞生长分化机制、雌孕激素对子宫内膜的作用机理以及母体子宫与胚胎之间的相互作用和应答反应的最佳材料。目前，子宫内膜细胞的分离培养已经在人[5]、小鼠[6]、兔[7]、奶牛[8]、牦牛[9]、绵羊[10]、猪[11]、山羊[12-13]等多种动物上获得成功，其中人和小鼠的相关研究较多、较成熟，其体外细胞模型已被广泛应用[14]。此外，还构建出永生化的人[15]、绵羊[16]和山羊[17]等子宫内膜细胞。近年来，山羊子宫内膜细胞的体外培养和相关应用不断取得新成果，为研究山羊生殖生理、内分泌和免疫等提供了基本材料和理论基础。笔者对目前现有的山羊子宫内膜细胞的体外培养技术及其应用的研究进展进行了综述，旨在为该技术在山羊上的进一步应用提供参考。

1 山羊子宫内膜细胞的体外分离

体外细胞的原代培养主要有组织块贴壁法和消化酶分散法等。其中，用消化酶分散成单细胞培养是最常用的方法，不仅操作简单，能在短时间内获得大量细胞，而且得到的细胞形态均一，成功率较高[18]。分离原代细胞常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶等。胰蛋白酶作用较强，消化速度虽快，但对细胞损害较大；胶原酶作用温和，对细胞损伤小。靳亚平等[19]对2种消化酶消化分解小鼠和山羊子宫内膜组织效果的比较也证实，用胶原酶于37 ℃下消化 4 h，得到的细胞活率最高。

2 山羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞的提取与纯化子宫内膜中主要含有基质细胞和上皮细胞。目前，从子宫内膜组织消化液中分别提取基质细胞和上皮细胞的常用方法有筛网过滤法和自然沉降法。筛网过滤法是利用2种细胞的体积差异，将细胞混悬液过200目或400目滤网，使其分离。自然沉降法是利用2种细胞沉降速度的不同，将细胞混悬液静置一段时间后，上皮细胞沉降到底部，而基质细胞仍在液体中，从而得以分离。

在山羊子宫内膜细胞的分离纯化方面，丰艳妮[12]和吴庆侠等[13]研究表明这2种方法都不能得到高纯度的山羊子宫内膜上皮和基质细胞。单纯的滤网过滤，仍有大量上皮细胞留在滤液中，得到的上皮细胞较少，基质细胞中也混有较多的上皮细胞，纯度低；自然沉降则因为消化液比较黏稠，耗时较长，此外沉淀中还混有未消化完全的组织块。他们分别首次对山羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞进行了分离培养，并取得了成功。结果发现，采用消化过滤-低速离心-自然沉淀相结合的方法能一次性分离到纯度高于95%的山羊子宫内膜基质和上皮细胞。

2.1 消化过滤

将子宫内膜剪成1 mm3左右小块，用D-Hanks液反复洗涤几次，直至液体变得清亮，以除去杂质细胞。然后，再将洗净的组织块放入三角瓶中，加入适量胶原酶，37 ℃下消化4 h后，用适量含胎牛血清的DMEM/F12培养液混匀，终止消化。将消化后的悬浊液用200目筛网过滤，以去除未消化的组织块，收集滤过液。

2.2 低速离心-自然沉淀

将过200目筛网的上述滤液，放入离心管中，低速离心，分别收集离心管内液体和管底沉淀，分别用于提取子宫内膜基质细胞和上皮细胞。

2.2.1 子宫内膜基质细胞的提纯。取上述离心后的管内液体，移至新离心管内，低速离心，取管内细胞沉淀，用D-Hanks液重新混匀，静置，待自然沉降一段时间后收集上部液体，再进行低速离心，弃去上层液体，将管底细胞沉淀用含胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬后接种培养。24 h后换液，得到纯度较高的子宫内膜基质细胞。

2.2.2 子宫内膜上皮细胞的提纯。取过滤网后首次离心的沉淀，加D-Hanks液重悬，低速离心后弃去上层液体，底部沉淀再用D-Hanks液混勻，静置，使细胞自然沉降后，收集沉淀，再用D-Hanks液重悬、静置、沉降。将最后得到的细胞沉淀加D-Hanks液重悬，离心，弃去上清，管底沉淀用含胎牛血清的DMEM/F12培养液混匀，接种培养2～3 d后换液，得到纯度较高的子宫内膜上皮细胞。

3 子宫内膜细胞的鉴定

根据上皮细胞和基质细胞形态特征的差异，进行初步鉴定；此外，还需要通过免疫组化染色加以确定。

3.1 细胞形态鉴定

新分离的山羊子宫内膜基质细胞一般为单个分散存在，贴壁较快，一般接种30 min即可贴壁，10 h后就开始生长，3～4 d后铺满培养瓶底。基质细胞呈梭形，相互平行并排列成束状，细胞胞质较稀薄而透明。

刚分离的山羊子宫内膜上皮细胞则呈细胞团块状存在，贴壁较慢，接种12 h后才开始贴壁，24 h后细胞团块外侧的细胞开始生长，7 d左右才能铺满瓶底。上皮细胞呈铺路石状，细胞间连接紧密，界限清晰，细胞质透明度小。上皮细胞生长缓慢，传代较难，2～3代后细胞就会出现空泡化而逐渐脱落。

3.2 免疫组化染色鉴定

子宫内膜上皮细胞中含有角蛋白，不含波形蛋白；子宫内膜基质细胞则含有波形蛋白，不含角蛋白。因此，可分别用角蛋白和波形蛋白作为一抗，对上皮细胞和基质细胞进行免疫组化染色加以区分。上皮细胞的染色结果角蛋白呈阳性、波形蛋白呈阴性，基质细胞的染色结果则为角蛋白呈阴性、波形蛋白呈阳性。

4 体外培养山羊子宫内膜细胞的应用

丰艳妮[20]通过将山羊子宫内膜上皮细胞与猪外周血单核细胞共培养，用培养过山羊子宫内膜细胞上皮细胞的培养上清液作为条件培养液，对外周血单核细胞进行培养。结果发现，2种培养方式都能显著刺激外周血单核细胞的增殖，并能抑制植物血球凝集素（PHA-P）对外周血单核细胞增殖的诱导作用。这表明子宫内膜上皮细胞可直接影响外周血单核细胞的活性，参与调节子宫免疫平衡。吴庆侠等[21]研究了山羊子宫内膜基质细胞培养上清液对山羊外周血单核细胞和外周血淋巴细胞转化与分泌活性的影响，结果发现基质细胞培养上清液可刺激外周血单核细胞和外周血淋巴细胞的转化以及IL-2、IL-4的分泌，并抑制PHA-P诱导的细胞增殖和IL-2分泌，但对PHA-P诱导的IL-4分泌具有促进或协同作用。这表明山羊子宫内膜基质细胞可能通过旁分泌途径来影响外周血单核细胞和外周血淋巴细胞的转化与分泌活性，从而调节子宫局部免疫调节。

由于体外培养的山羊子宫内膜细胞较难传代，特别是上皮细胞，并且随着培养时间的延长，细胞容易出现变异而失去利用价值，细胞数量也难以达到研究要求。因此，目前对山羊子宫内膜细胞的研究主要集中在永生化细胞系的建立和应用上。

吴庆侠等[22]和盛宏霞等[23]分别将人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因导入原代山羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞中，获得的阳性克隆细胞与原代细胞具有相同的形态特征与生物学特性，具有较高的端粒酶活性，并保持了对雌孕激素刺激的正常应答反应。永生化的细胞增殖能力增强，传代稳定，可为构建子宫内膜体外模型、研究子宫局部免疫调节等提供大量的、表型一致、功能正常的试验材料。南志春等[24]利用永生化的山羊子宫内膜细胞证实基质细胞对上皮细胞IL-18的分泌活性有调节作用。屈延延等[25]研究表明在性腺激素作用下永生化山羊子宫内膜基质细胞对上皮细胞的TNF-α与TGF-β分泌活性有重要影响。廖庆红等[26]研究表明山羊子宫内膜细胞与性腺激素对子宫自然杀伤细胞（uNK）分泌血管内皮生长因子（VEGF）和γ-干扰素（IFN-γ）的活性有不同程度的调节作用。

此外，研究者还利用永生化的山羊子宫内膜细胞作为体外模型，对子宫内膜相关疾病进行了研究。白东宁等[27]以永生化山羊子宫内膜上皮细胞作为体外模型，观察了乳酸菌和一些致病菌对子宫内膜上皮细胞的黏附特性，结果发现乳酸菌和致病菌对子宫内膜上皮细胞都有很强的黏附性，而乳酸菌对这些病原菌的黏附性有不同程度的拮抗作用，表明永生化山羊子宫内膜上皮细胞可作为研究细菌黏附性的切实有效的体外材料。邝晓娇等[28]利用永生化的山羊子宫内膜上皮细胞，建立子宫内膜上皮细胞炎症模型，研究丹参水提物对山羊子宫内膜上皮细胞炎症模型中基质金属蛋白酶-2表达的影响，结果表明丹参水提物对内毒素引起的子宫内膜炎症反应有一定的保护作用。

5 小结

综上所述，目前已经在体外成功分离到山羊子宫内膜细胞，并构建了永生化的山羊子宫内膜细胞。利用永生化的山羊子宫内膜细胞，研究人员对山羊子宫内膜细胞的生殖生理功能和子宫内膜炎症机制进行了深入探讨。然而，目前对山羊子宫内膜细胞的研究仍不够广泛和深入。今后对山羊子宫内膜细胞的研究可利用永生化的山羊子宫内膜细胞对子宫内膜的生殖生理变化、药物筛选和子宫内膜炎症机制等方面进行进一步探讨，从而为山羊子宫内膜相关疾病的研究提供基础。

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