MTT法评价二甲基亚砜对中国仓鼠肺成纤维细胞增殖率的影响

张娜，张鹏，景明

（天津市医疗器械质量监督检验中心，天津300384）

MTT法评价二甲基亚砜对中国仓鼠肺成纤维细胞增殖率的影响

张娜，张鹏，景明

（天津市医疗器械质量监督检验中心，天津300384）

为评价不同浓度二甲基亚砜（DMSO）对中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）增殖率的影响，通过制备含3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%和0.5% 6个浓度DMSO的细胞培养液作为测试样品与CHL细胞进行接触，进行MTT试验。结果表明，各浓度测试样品的细胞增殖率在40%-96%，由此说明CHL细胞增殖率随DMSO浓度的降低而增高，二者呈负相关关系。

二甲基亚砜；仓鼠；增殖

在传统的医疗器械安全性评价试验中，往往采用单一浸提介质进行测试。而随着医疗器械的发展，越来越多的新材料用于医疗器械设计制造，同时监管制度也在逐步完善，因此需要采用更加多样化的浸提介质来对医疗器械的安全性进行评价[1]。

DMSO由于同时具备极性和非极性溶剂的特点，被逐步应用于医疗器械安全性评价试验[2]。而高浓度的DMSO具有明确的细胞毒性作用。因此，将其应用于医疗器械安全性评价试验中的体外染色体畸变试验前，需要选择一个适当的测试浓度，以保证染色体畸变试验所用CHL细胞的正常生长。

本文选用MTT法测定DMSO对CHL细胞的增殖率的影响。而在细胞增殖率测定试验中，MTT法是较为灵敏且被广泛接受的一种浸提液检测方法。该试验原理是哺乳动物活细胞的线粒体酶可将外源性MTT降解形成蓝紫色的物质，而死细胞则无此功能，从而定量测定细胞的相对增殖率[3]。

1 材料与方法

1.1 试验细胞株

CHL细胞，由中国药品生物制品鉴定所医疗器械质量监督检验中心提供。

1.2 试验样品

DMSO，Merck公司提供。

1.3 试验样品稀释液制备

采用含10%胎牛血清的MEM培养基作为稀释液，将DMSO样品稀释为3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%和0.5% 6个浓度。

1.4 试验分组

设立空白对照组，含10%胎牛血清的MEM培养基；阴性对照，高密度聚乙烯浸提液，浸提介质为含10%胎牛血清的MEM培养基，浸提条件为（24±2）h；阳性对照，5%DMSO。

1.5 试验方法

①将配制好的1×104个/mL细胞悬液接种于96孔培养板，每孔接种0.1mL。设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和各试验样品浸提液组，每组6孔，置于5%CO2、（37±1）℃培养箱，培养（24±2）h后，弃去原培养液。各组加入相应制备好的溶液，每孔0.1mL，于5% CO2、（37±1）℃条件下继续培养（72±2）h后，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入0.02mL质量浓度5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，再加入0.15mL DMSO，置振荡器上振荡10min，在酶标仪570nm波长下测定吸光度（参比波长为630nm），计算每组相对增殖率。②细胞毒性反应分级判定：相对增殖率≥100%为0级，80%～99%为1级，50%～79%为2级，30%～49%为3级，0%～29%为4级。③试验成立条件：阴性对照组的反应不大于1级，阳性对照组至少为3级，否则应重新试验。④进行4组平行试验。

2 结果与分析

2.1 细胞形态观察结果

与细胞接触72h，在倒置显微镜下观察各组细胞形态，空白对照组、阴性对照组、1.0%、0.5%试验样品组细胞生长良好，数量未见明显减少；2.0%、1.5%试验样品组细胞生长状态较差，数量明显减少；3.0%、2.5%试验样品组合阳性对照组细胞层完全破坏。

2.2 DMSO浓度对吸光值影响

DMSO浓度组对吸光值影响如表1所示。

2.3 DMSO浓度对增殖率影响

DMSO浓度组相对增殖率计算公式如下：RGR/%=供试品组各组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。本试验阴性对照的相对增殖率为98%～99%，反应分级均为0级，阳性对照组增殖率为6%～8%，反应分级均为4级，均符合试验成立条件，各组样品结果统计见表2所示。

表1 各组试验结果（吸光度均值）

表2 每组相对增殖率

2.4 DMSO浓度与细胞增值率的关系

DMSO浓度变化与细胞增值率的关系如图1所示。

图1 DMSO浓度与细胞增殖率的关系

从图1可见，DMSO浓度变化与细胞增值率关系呈线性关系。CHL细胞增殖率随DMSO浓度的降低而增高，二者呈负相关关系。

3 结论

本文通过MTT法对6个浓度DMSO溶液对CHL细胞的增殖率影响进行了4次平行试验。结果显示：①CHL细胞增殖率随DMSO浓度的降低而增高，二者呈负相关关系；②当DMSO浓度为2.0%时，CHL细胞增殖率能够达到50%以上，满足遗传毒性试验中染色体畸变试验的相关要求。

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 16886.5-2003医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验[S].北京:中国标准出版社,2003.

[2]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 16886.12-2005 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品[S].北京:中国标准出版社,2005.

[3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法[S].北京:中国标准出版社,2005.

Effect of Two Methyl Sulfoxide on Proliferation Rate of Chinese Hamster Lung Fibroblast Cells by MTT

Zhang Na,Zhang Peng,Jing Ming
(Tianjin Medical Devices Quality Supervision and Testing Center,Tianjin 300384)

In order to evaluate the effects of different concentrations of two methyl sulfoxide (DMSO) on the proliferation of Chinese hamster lung fibroblasts (CHL),the cell culture medium containing 3.0%,2.5%,2.0%,1.5%,1.0% and 0.5% DMSO was prepared as the test sample,the test samples and CHL cells were exposed to carry out MTT test.The results showed that the cell proliferation rate of the samples was 40%-96%,which indicated that the proliferation rate of CHL cells was increased with the decrease of DMSO concentration,and there was a negative correlation between the proliferation rate of cells.

Two methyl sulfoxide;Hamster;Proliferation

R135.1

A

2096-0387（2017）03-0050-03

张娜（1987-），女，天津人，硕士，工程师，研究方向：医疗器械生物学安全评价。