声脉冲辐射成像技术在早期非酒精性脂肪性肝炎诊断中的应用价值

何蒙娜，吕 珂，朱庆莉，张 青，李文波，唐鹤文，赵 婧，张 睿，姜玉新

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院超声医学科，北京 100730



·论 著·

声脉冲辐射成像技术在早期非酒精性脂肪性肝炎诊断中的应用价值

何蒙娜，吕 珂，朱庆莉，张 青，李文波，唐鹤文，赵 婧，张 睿，姜玉新

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院超声医学科，北京 100730

目的 评估声脉冲辐射成像技术(ARFI)在早期非酒精性脂肪性肝炎(NASH)诊断中的应用价值。方法 采用随机数字表法将32只SD大鼠随机分为普通饲料组(n=8)和高脂饲料组(n=24)，分别于4、8、12、16周末从高脂饲料组及普通饲料组随机抽取6只及2只行体质量、血生化、常规超声及ARFI检测，处死后取大鼠肝脏行HE染色，观察病理。结果 32只大鼠均未出现肝纤维化，根据病理结果分为M1组[轻中度单纯性脂肪肝(SS)]、M2组(重度SS)、M3组(重度SS合并早期NASH)和C组(正常对照)4组，早期NASH仅出现在重度脂肪肝组，其分布差异有统计学意义(P=0.006)。常规超声诊断脂肪肝程度与病理检查结果的符合率为34.4%(11/32)。M3组的ARFI值为(1.16±0.04)m/s，明显低于M2组的(1.22±0.05)m/s(t=2.301，P=0.04)；M3组的LDL-C为(1.53±0.07)mmol/L，明显高于M2组的(1.21±0.22)mmol/L(t=3.075，P=0.01)；两组大鼠在三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和体质量方面差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 早期NASH的出现与脂肪肝程度相关。ARFI值可为重度SS患者是否合并早期NASH提供重要信息。

非酒精性脂肪性肝炎；声脉冲辐射力成像技术；单纯性脂肪肝

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：401-405

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是最常见的慢性肝脏疾病之一，在人群中的患病率为20%～30%[1]，其定义的关键是排除其他原因的肝脏脂肪变，为排他性诊断，排除的原因有酒精性，继发性包括病毒性肝炎、药物性及遗传性肝炎等。NAFLD的疾病谱包括单纯性脂肪肝(simple steatosis，SS)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化、肝癌等[2]。目前认为SS为NAFLD的良性状态，而NASH则为NAFLD的进展状态，有较高的风险进展为肝硬化甚至肝癌[3]。NASH的病理特征有肝细胞坏死、炎症细胞浸润，伴或不伴有肝纤维化，在NAFLD人群中发生率约为3%～5%。NASH的发生机制目前较认可的是 “二次打击”学说，即首先肝细胞出现三酰甘油的堆积，继而增加肝细胞的敏感性，使其更易受到第2次打击，包括肝细胞损伤、炎症细胞浸润及纤维化等[4]。

对于NAFLD患者，诊断的关键是鉴别尚未出现纤维化的早期NASH，此期虽然已经为NAFLD疾病谱中的进展期，但仍可通过干预后恢复，因此是治疗的关键时间。肝穿刺活检是目前诊断慢性肝病的金标准，然而由于其有不可避免的并发症与死亡率，NAFLD患者难以常规接受，无创诊断的方法层出不穷[2，5]。Di Marco 等[6]将声脉冲辐射力成像技术(acoustic radiation force impulse，ARFI)应用于肝纤维化程度的分级，取得到了一些较好的相关性结果，并由此认为ARFI在肝脏慢性疾病的诊断中具有良好的应用前景。本研究建立了尚未出现纤维化的早期NASH大鼠模型，检测了其临床和超声指标，分析了其与SS的差异，评估了ARFI在NASH早期诊断中的应用价值。

材料和方法

实验动物分组及NASH模型建立 2月龄雄性SPF级SD大鼠32只，体质量(373.6±10.1)g(358～397 g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物合格证号：SYXK(京)2015- 0025]。采用随机数字表法将大鼠分为普通饲料组(n=8)和高脂饲料组(n=24)，分别于4、8、12、16周末从高脂饲料组及普通饲料组随机抽取6只及2只测量体质量及用于实验。高脂饲料及其配方：87%普通饲料，10%猪油，1.5%食盐，0.5%糖，1%胆固醇。

ARFI的测量 对所需探查部位备皮，将大鼠固定于合适体位，采用西门子AcusonS2000超声诊断仪，用9L4探头，保持相同的探头力度及时间补偿增益，避开管道结构，固定深度于距肝脏包膜1～2 cm处[7]，测量该处的ARFI值10次[8]，数值经检验后符合正态分布取平均值，单位为m/s。

血生化及病理检查 将禁食后大鼠麻醉固定于合适体位，超声定位标记心脏部位后，用25G、1 ml注射器从心脏采血1 ml，分离血清，送至北京协和医院检验科检测谷草转氨酶(aspertate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、三酰甘油(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL-C)，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL-C)。采血完成后，处死大鼠并解剖分离肝脏，各肝叶各取2 cm×1 cm大小组织保存于10%中性甲醛溶液，24 h送至病理科。病理结果判断根据肝细胞脂肪变性程度的病理诊断标准分为：(1)轻度：1/3～1/2；(2)中度：1/2～2/3；(3)重度：>2/3。根据肝细胞是否有坏死、气球样变及小叶内或汇管区炎症细胞浸润判断是否合并NASH，同时观察是否合并有纤维化的出现。

统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，组间均数比较采用独立样本t检验，分类变量比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

病理结果及分组 32只大鼠肝脏均未出现肝纤维化表现。普通饲料组8只大鼠均未出现NAFLD疾病谱的表现(C组)。高脂饲料组24只大鼠中，11只为单纯性轻中度脂肪肝(M1组)；8只为单纯性重度脂肪肝(M2组)，5只为重度脂肪肝合并早期NASH模型(M3组)；均为高脂饲料喂养16周后解剖所得；早期NASH在不同程度脂肪肝的分布中差异有统计学意义(P=0.006)(图1)。

常规超声结果 以病例结果为标准，常规超声扫描结果显示，C组8只大鼠中，4只诊断正确，4只诊断错误；M1组11只大鼠中，7只诊断正确，4只诊断错误；M2组8只大鼠均诊断错误；M3组5只大鼠也均诊断错误；诊断脂肪肝程度与病理检查结果的符合率为34.4%(11/32)。

ARFI值及血生化结果 C组、M1组、M2组、M3组的ARFI值分别为(0.99±0.10)、(1.13±0.04)、(1.22±0.05)、(1.16±0.04)m/s，其中，M3组的ARFI值明显低于M2组(t=2.301，P=0.04)。M3组的LDL-C为(1.53±0.07)mmol/L，明显高于M2组的(1.21±0.22)mmol/L(t=3.075，P=0.01)，两组大鼠在TG、TC、HDL-C、AST、ALT和体质量方面差异均无统计学意义(P均>0.05)(表1)。

SS：单纯性脂肪肝；NASH：非酒精性脂肪性肝炎

SS：simple steatosis；NASH：non-alcoholic steatohepatitis

A. 重度SS大鼠肝脏大体表现；B. 重度SS大鼠肝脏镜下病理表现(HE，×200)；C. 重度SS大鼠肝脏常规超声表现；D.早期NASH组大鼠肝脏大体表现；E.早期NASH组大鼠肝脏镜下病理表现(HE，×200)；F.早期NASH组大鼠肝脏常规超声表现

A. morphological finding of rat’s liver with severe SS；B. microscopically histological finding(HE，×200)of rat’s liver with severe SS；C. conventional ultrasound finding of rat’s liver with severe SS；D. morphological finding of rat’s liver with early NASH；E. microscopically histological finding of rat’s liver with early NASH(HE，×200)；F. conventional ultrasound finding of rat’s liver with early NASH

图 1 单纯性重度脂肪肝组与合并早期NASH重度脂肪肝组的病理及超声图像比较

Fig 1 Comparison of pathological and ultrasound findings between simple severe hepatic steatosis group and the group of severe hepatic steatosis with early NASH

表 1 单纯性重度脂肪肝与合并早期非酒精性脂肪性肝炎的重度脂肪肝大鼠的各项指标比较(x-±s)

ARFI：声脉冲辐射成像；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白；HDL-C：高密度脂蛋白；AST：谷草转氨酶；ALT：谷丙转氨酶

ARFI：acoustic radiation force impulse；TC：total cholesterol；TG：triglyceride；LDL-C：low-density lipoprotein；HDL-C：high-density lipoprotein；AST：aspertate aminotransferase；ALT：alanine transaminase

讨 论

本研究采用高脂饲料喂养制造NASH大鼠模型，较四氯化碳诱导而成的模型，与临床NASH患者的病理生理形成过程有更好的相似性，且均未出现大鼠死亡。病理结果显示，高脂饲料诱导的NASH模型也均未出现肝纤维化或者更严重的肝硬化、肝癌。已知大鼠的寿命为2～3年，本研究高脂诱导16周即出现早期NASH，相当于人类寿命的1/7～1/8，一定程度说明即使对NAFLD不干预，并且持续高脂饮食，其出现早期NASH的病理表现也需较长时间。因此，对于NAFLD患者，虽然疾病不会快速向NASH进展，但正由于其较长的“潜伏期”及相对温和的发展速度，早期NASH的出现在临床工作中容易忽视，从而错过早期干预的恰当时间。本研究结果显示，早期NASH在不同程度脂肪肝NAFLD大鼠中的分布有明显差异，仅出现在重度脂肪肝组，提示重度脂肪肝为出现早期NASH的高危信号，对脂肪肝程度已经达到重度的NAFLD患者，需要警惕合并早期NASH的可能。

早期NASH有潜在的风险进展为伴有肝纤维化的NASH，肝硬化、肝功能衰竭及肝癌，肝穿活检作为诊断的金标准，由于其有费用高、存在取样误差及操作相关的并发症及死亡率，较难被临床及患者接受与推广。学者们致力于探索一种无创的临床生化或者影像学诊断指标来鉴别NASH，但均未得出有效的提示指标。早期NASH患者的肝功能、血脂都有可能在正常范围，所以它们没有足够的敏感性来鉴别NASH[2]；也有学者希望通过NASH形成的分子机制及遗传学特征来鉴别诊断及治疗NASH，但均处于基础研究阶段；超声检查一直作为肝脏疾病的首选影像学检查方法，但常规超声对脂肪肝程度的诊断效力较低，对早期NASH所能提供的信息有限；随着定量超声检测方法的不断出现，使得一部分超声检查项目有机会从完全主观判断向定量化发展，为临床提供更多有价值的信息。其中ARFI技术于2008年首次应用于无创评估肝纤维化的严重程度，其值与肝硬度密切相关[9]。该技术简单易行，无创伤，为临床工作从视觉经验检查到数字量化检查提供了新的方法。但尚无研究将ARFI技术聚焦于早期NASH的鉴别诊断。本研究希望通过检测常用临床生化及影像指标分析尚未出现纤维化的早期NASH大鼠与单纯性脂肪肝的差异，从而为鉴别早期NASH提供无创诊断信息。

本研究结果还发现，M3组的ARFI值为(1.16±0.03)m/s，明显低于M2组的(1.22±0.05)m/s，推测其原因可能为炎症细胞浸润增加了肝脏脂肪变细胞之间的距离，再加上炎症的出现使肝细胞水肿，从而降低了脂肪变细胞的分布密度。所测得临床生化指标则显示M3组除LDL-C值明显高于M2组外，其余的TG、TC、HDL-C、AST、ALT及体质量等指标与M2组无统计学差异，这说明随着早期NASH的出现，反映肝功能的指标AST、ALT改变不明显，仍处于正常范围，意味着肝功能处于完全代偿期，临床无法仅通过其来提示早期NASH的出现；而血脂指标除LDL-C继续升高，其余大部分指标TG、TC、HDL-C也无明显变化，能为鉴别早期NASH提供的信息有限；回顾所测得的临床及超声影像学指标，发现如果将ARFI值的变化联合血脂、肝功等，可为鉴别早期NASH提供重要信息：即当肝功能指标AST、ALT处于正常范围内，LDL-C继续升高，而TC、TG、HDL-C等指标变化不明显时，若重度脂肪肝患者的ARFI值由高到低转变，则需要排除出现早期NASH的可能。

以大鼠为模型的最大优势是可以取到实时病理标本，为研究提供对照的金标准，但大鼠模型却不能完全替代人体肝脏研究，其原因有以下几点：(1)大鼠肝脏的前后径线远小于人类肝脏，这将影响ARFI测量时感兴趣区域(region of interest，ROI)的选择深度，曾有学者研究发现，在测量儿童肝脏ARFI值时，随着ROI选择深度的增加，其值也增加[10]；(2)大鼠的心率大于300次/min，而大鼠的肝脏紧邻心脏，不可避免会影响ARFI测值的稳定性；(3)本研究所用的为9L4线阵探头，而人体肝脏测量常规选择4C1凸阵探头，Goertz等[11]报道9L4探头所测ARFI值高于4C1探头。本研究另一个局限性为由于相对较少的样本量，病理结果显示仅在重度脂肪肝组出现早期NASH，但无法排除轻中度脂肪肝是否也会合并早期NASH，同时本研究将未出现纤维化的NASH统一归为早期NASH，由于数量有限，并未对早期NASH进行活动度评分而进一步分类，今后仍需通过扩大样本量及增加喂养时间来进一步研究。

总之，本研究成功建造了早期NASH的大鼠模型，并通过研究早期NASH的发生发展过程得出早期NASH的出现与脂肪肝程度相关，ARFI值在早期NASH发生发展中的变化可为重度脂肪肝是否合并早期NASH提供重要信息。

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Value of Acoustic Radiation Force Impulse Imaging in the Diagnosis ofEarly Non-alcoholic Steatohepatitis

HE Mengna，LÜ Ke，ZHU Qingli，ZHANG Qing，LI Wenbo，TANG Hewen，ZHAO Jing，ZHANG Rui，JIANG Yuxin

Department of Ultrasound，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，ChinaCorresponding author：JIANG Yuxin Tel：010- 69155491，E-mail：yuxinjiangxh@163.com

Objective To evaluate the value of acoustic radiation force impulse(ARFI)imaging in the diagnosis of early non-alcoholic steatohepatitis(NASH).Methods Totally 32 SD rats were randomly divided into high-fat diet group(n=24)and normal-diet group(n=8)by using the random number table. At the end of the 4th，8th，12th，and 16thweek，six rats from the high-diet group and two rats from the normal-diet group were selected blindly for weighting，blood biochemical test，conventional ultrasound，and ARFI imaing. HE staining was used for pathological observation. Results None of the 32 rats developed liver fibrosis. Based on the pathological results，these rats were divided into M1 [mild-to-moderate simple fatty liver(SS)]，M2(severe SS)，M3(severe SS with early NASH)，and C groups(normal control). Early NASH was seen only in the severe hepatic steatosis groups，and its distribution had a significant difference(P=0.006). The diagnostic accuracy of conventional ultrasound based on histological results was 34.4%(11/32). The ARFI value of M3 group was significantly lower than that of M2 group [(1.16±0.04)m/svs.(1.22±0.05)m/s；t=2.301，P=0.04)，and the low-density lipoprotein of M3 group was significantly higher than M2 group [(1.53±0.07)mmol/Lvs.(1.21±0.22)mmol/L；t=3.075，P=0.01)，while other clinical indicators had no statistical difference between these two groups. Conclusions The development of early NASH is associated with the severity of hepatic steatosis. ARFI value can provide important information to identify early NASH in patients with severe hepatic steatosis.

non-alcoholic steatohepatitis；acoustic radiation force impulse；simple steatosis

中国医学科学院北京协和医学院研究生创新基金(2014- 10023- 1002- 3008)Supported by the Innovation Fund for Graduate Students of Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College(2014- 10023- 1002- 3008)

姜玉新 电话：010- 69155491，电子邮件：yuxinjiangxh@163.com

R445.1；R657.3

A

1000- 503X(2017)03- 0401- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.017

2016- 07- 29)