年龄与性别对氯吡格雷抗血小板疗效与PON1 Q192R基因多态性相关性的影响

徐晓宇，石秀锦，续茜桥，彭文星，林 阳

（首都医科大学附属北京安贞医院药剂科，北京 100029）

年龄与性别对氯吡格雷抗血小板疗效与PON1 Q192R基因多态性相关性的影响

徐晓宇，石秀锦，续茜桥，彭文星，林 阳

（首都医科大学附属北京安贞医院药剂科，北京 100029）

目的：本研究回顾性分析了年龄和性别对PON1 Q192R基因多态性与氯吡格雷抗血小板疗效之间相关性的影响。方法：收集1254例纳入研究的患者连续服用标准双抗≥3天后测得的血小板聚集率（PAR），将PAR ＞ 50%定义为氯吡格雷抵抗（CR）。比较不同年龄组及不同性别的人群中PON1 Q192R基因型与CR的相关性。结果：本研究人群PON1 Q192R最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）为37%。在整体人群中，PON1 Q192R突变纯合型（A/A）患者中CR发生率（59.39%）与野生型（G/G）患者（43.58%）及突变杂合型（G/A）患者（49.00%）中CR发生率相比具有显著差异（P2 ＜ 0.001，P3 = 0.02）。在≤65岁的患者中，G/G型患者的CR发生率（41.69%）与A/A型（57.58%）相比有显著性差异（P2 ＜ 0.001），而在＞ 65岁的老年患者中，不同基因型CR发生率虽有不同，但差异无统计学意义（P1，P2，P3 ＞ 0.05）。男性患者中CR发生率（45.87%）显著低于女性（53.91%，P = 0.01）。同时，在男性患者中，G/G型患者CR的发生率（40.63%）与A/A型（57.02%）相比有显著性差异（P2 ＜ 0.001），而在女性患者中，不同基因型的患者间，CR发生率无明显差异（P1，P2，P3 ＞ 0.05）。结论：高龄和女性作为CR的独立危险因素，会削弱PON1 Q192R基因多态性造成的个体间氯吡格雷抗血小板疗效的差异。

氯吡格雷；PON1 Q192R；年龄；性别

氯吡格雷作为经典的吩噻吡啶类抗血小板药，广泛应用于经皮冠状动脉介入术（PCI）术后患者的抗血小板治疗。作为一种前体药物，氯吡格雷在体内经过两步活化才能发挥抗血小板作用，其活化过程中所需酶的活性降低可能会减弱其抗血小板疗效，进而导致出血或支架内血栓等不良事件。自Bouman等[1]报道对氧磷酶-1（PON-1）可能是氯吡格雷体内第二步活化过程中的关键酶，近期Chen等[2]的研究结果显示PON1 Q192R基因多态性与氯吡格雷抗血小板疗效及远期不良心血管事件相关。但目前国内外研究结果并不一致[2-10]。各项研究的研究人群的人种、数量、年龄及性别分布以及研究的评价指标不同可能是造成研究结果不一致的原因之一。

氯吡格雷通过抑制二磷酸腺苷（ADP）受体发挥作用，其抗血小板疗效的发挥不仅受遗传因素的影响，此外还可能与年龄、性别、合并症及合并用药相关。本研究从遗传学角度对年龄与性别对CR与PON1 Q192R基因多态性之间相关性的影响进行初步评价，寻找进行氯吡格雷相关基因检测获益更大的群体，以期给临床提供参考，节约医疗成本。

1 资料与方法

1.1 研究人群

回顾性收集2007年11月– 2016年3月在安贞医院行PCI手术，并进PON1 Q192R基因多态性检测的患者7793例，通过本研究的纳入排除标准，最终共筛选出1254例患者。

纳入标准：①明确手术记录行PCI的患者；②入院后接受阿司匹林100 mg·d-1和氯吡格雷75 mg·d-1标准双抗≥3天后[11]进行血小板聚集率（platelet aggregation rate，PAR）检查；或出院后门诊记录为在我院门诊规律处方标准剂量阿司匹林和氯吡格雷，其血小板聚集率检测时间在其处方量时间范围内。

排除标准：①严重肾功能不全（Cr ＜ 30 mL·min-1）；②合并出血性疾病；③合并使用华法林、双嘧达莫或其他新型口服抗凝药（如：达比加群酯、利伐沙班等）；④血小板聚集率检测前3天内更改药物剂量或漏服；⑤血小板计数＜ 100×109·L-1。

1.2 血小板聚集率检测

患者规律服用标准双抗≥3 d，于晨起服药2.5 h后，用含3.8%枸橼酸钠抗凝管采集肘静脉血，充分混匀。先将试管在4000 ～ 5000 r·min-1条件下离心5 min，获得富含血小板的血浆（PRP），然后吸取PRP后剩余的血样经22 500 r·min-1高速离心15 min获取贫血小板血浆（PPP）。把PPP和PRP混合，将血小板浓度稀释至2×105μmol·L-1，加入6 μmol·L-1的ADP诱导血小板聚集，之后测定血小板聚集率，仪器使用的是Chrono-Log Lune Aggregometer（model 700，美国）。根据Barragan等[12]人的研究，将PAR ＞ 50%定义为氯吡格雷抵抗。

1.3 SNP检测与分型

用EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝管采血2 ～ 3 mL，采用荧光染色原位杂交检测法。取150 μL血加入1 mL红细胞裂解液，静置5 min后，3000 r·min-1离心5 min，弃上清液，再加入核酸纯化试剂（北京华夏时代基因科技发展有限公司），混匀后加入相应的测序反应通用试剂（北京华夏时代基因科技发展有限公司），采用双通道实时荧光定量PCR仪（TL988A，西安天隆科技有限公司）进行检测。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS20.0对数据进行统计学处理及分析。正态性连续性变量采用（均值±标准差）表示，计数资料用百分比表示。正态性连续性变量采用双侧t检验比较两组之间的差异，计量资料采用卡方检验或者Fisher精确检验，以P ＜ 0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 基本资料

本研究共纳入1254例PCI术后患者，其中男性883例，女性371例。根据PAR结果将患者分为氯吡格雷抵抗组（CR组）和氯吡格雷非抵抗组（NCR组），两组患者的BMI、肾功能、合并症（糖尿病、高脂血症）及合并用药（β受体阻滞剂、他汀、质子泵抑制剂及ACEI/ARB）等基本临床信息无显著性差异（P ＞0.05），见表1。

表1 CR组与NCR组患者的基本信息Tab 1 The clinical information of CR and NCR groups

2.2 PON1 Q192R各基因型分布频率及等位基因频率

对1254例患者的PON1 Q192R基因型进行统计，其中野生型（G/G）的分布频率为39.15%，突变杂合型（A/G）的分布频率为47.69%，而突变纯合型（A/A）为13.16%。该研究人群中PON1 Q192R的最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）为37%（见表2），国际千人基因组计划（1000 genomes project）中北京汉人PON1 Q192R的MAF为41%，两者接近，统计学比较无显著性差异（P = 0.56）。

表2 PON1 Q192R基因型频率及等位基因频率Tab 2 The gene frequencies of PON1 Q192R

2.3 不同年龄段患者CR发生率与PON1 Q192R基因型的关系

在该研究的总体人群中有605例CR患者，占研究人群总体的48.25%。根据PON1 Q192R基因型将患者分为3组，分别为G/G组、G/A组和A/A组，CR的发生率分别为43.58%，49.00%和59.39%，组间比较结果显示G/G组与G/A组的CR发生率无显著性差异（P = 0.08，P ＞ 0.05），而A/A组发生CR的概率明显高于G/G组和G/A组（P2 = 0.00，P3 = 0.02，结果见表3）。

根据国际规定，＞ 65岁为老年人，有文献报道[13-14]，高龄也是发生氯吡格雷抵抗的危险因素之一。因此本研究将研究人群按照年龄分为≤65岁组和＞ 65岁组。＞ 65岁组的CR发生率略高于≤65岁组（51.76% vs 47.03%，P = 0.53 ＞ 0.05）。在≤65岁组各基因型患者中，CR的发生率分别为41.69%，48.42%和57.58%，组间比较结果显示，在≤65岁人群中，A/A组与G/G组CR的发生率有显著性差异（P = 0.00 ＜ 0.01）。而在＞ 65岁组中各基因型患者CR的发生率分别为49.19%，50.64%和66.67%，组间比较均无显著性差异（P ＞ 0.05）。PON1 Q192R基因多态性造成的个体间氯吡格雷疗效差异在≤65岁的人群中更显著，在＞ 65岁的患者中该差异明显减小。

表3 不同年龄段患者的CR发生率与PON1 Q192R基因型的关系Tab 3 The relationship between PON1 Q192R genetypes and CR in different ages

2.4 性别对PON1 Q192R基因多态性与CR发生率之间相关性的影响

既往研究结果显示[14-17]，女性是氯吡格雷抵抗的一个独立危险因素。对本研究人群中，CR发生率在女性患者中为53.91%，明显高于男性患者（45.87%），差异有统计学意义（P = 0.01，见表4）。

将研究人群分为男、女两组，分别比较两组患者中PON1 Q192R基因多态性与CR之间的相关性。研究发现，在男性患者中，CR在不同PON1 Q192R基因型中的发生率分别为40.63%，47.07%和57.02%，A/A组与G/G组CR的发生率有显著性差异（P = 0.00）。而在女性患者中，CR在不同基因组中的发生率分别为51.08%，53.19%和65.91%，组间比较均无显著性差异（P ＞ 0.05）。同时相同基因组的患者，女性患者CR的发生率均高于男性（见表4）。

表4 不同性别患者的CR发生率与PON1 Q192R基因型的关系Tab 4 The relationship between PON1 Q192R genetypes and CR in different gender

3 讨论

本研究根据患者服药后的PAR来评价氯吡格雷的抗血小板疗效，Barragan等[12]将PAR ＞ 50%界定为血小板高反应性，即氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）。本研究的数据处理结果显示，经规律标准双抗治疗后，个体间PAR差异较大，最大值为96%，而最小值仅为2%，在研究总体中CR的发生率高达48.25%。

根据患者PAR将患者分为CR组与NCR组，两组患者的临床基本情况无显著性差异（P ＞ 0.05）。

3.1 在研究总体中PON1 Q192R基因多态性与氯吡格雷抵抗的相关性

收集患者PON1 Q192R基因检测结果，对患者的PON1 Q192R基因型进行统计分析，结果显示，该研究人群的MAF与国际千人基因组计划中中国人群的MAF相近，差异无统计学意义。说明该研究人群基本可以代表中国人群。

在研究的总体人群中，PON1 Q192R基因多态性与CR的发生具有明显的相关性，CR的发生率在G/G组的患者中最低（43.58%），在G/A组和A/A组患者中CR的发生率逐渐升高（49.00%和59.39%）。且A/A组CR的发生率与G/G组和G/A组比较有显著性差异。因此，在整体人群中，PON1 Q192R基因突变可使患者的CR发生风险增加。

3.2 不同年龄组患者中PON1 Q192R基因多态性与氯吡格雷抵抗的相关性

根据国际老年人划分标准，将本研究人群根据年龄分为≤65岁和＞ 65岁两组，两组CR发生率相近（47.03% vs 51.76%），虽＞ 65岁组的CR发生率较≤65岁组高，但无统计学差异。分别研究不同年龄段的患者中PON1 Q192R基因型与CR发生率的关系，结果显示，在≤65岁的患者中，PON1 Q192R基因型与CR具有明显的相关性，但在＞ 65岁的患者中PON1 Q192R与CR相关性减弱，虽然携带突变基因的患者中CR的发生率依然大于未携带突变基因的患者，但是组间比较无统计学意义。同时，具有相同基因型的患者，＞ 65岁患者CR的发生率明显高于≤65岁的患者。因此，高龄是氯吡格雷抵抗的一个危险因素，可以削弱PON1 Q192R与氯吡格雷抵抗之间的相关性。

3.3 不同性别的研究人群中PON1 Q192R基因多态性与氯吡格雷抵抗的相关性

最后，分别对男性和女性患者中，PON1 Q192R基因多态性与CR的相关性进行研究，结果显示在男性患者的CR发生率为45.87%，显著低于女性患者（53.91%）。因此女性可能是CR发生的一个独立危险因素。在男性患者中PON1 Q192R基因多态性与氯吡格雷疗效具有明显相关性，组间差异有统计学意义。然而在女性患者中，虽然PON1 Q192R基因突变也会增加CR的发生率，但是组间比较无统计学差异。作为CR的一个独立危险因素，女性患者中PON1 Q192R基因多态性造成的氯吡格雷抗血小板疗效的个体间差异会被削弱。

综上所述，高龄和女性作为氯吡格雷抵抗的危险因素，会削弱PON1 Q192R基因多态性造成的个体间氯吡格雷疗效的差异，使CR与PON1 Q192R基因多态性的相关性降低。因此，在≤65岁的男性患者中进行PON1 Q192R基因检测会更有意义。同时该研究结果也提醒广大临床医生及药师，即使患者PON1 Q192R基因型检测显示为正常代谢型（野生纯合型），也不能判断患者一定不存在氯吡格雷抵抗现象，需考虑高龄、性别等其他可能造成氯吡格雷抗血小板治疗低效甚至无效的因素。

本研究为回顾性研究，且仅通过实验室指标对氯吡格雷抗血小板疗效进行评价，未收集心血管不良事件等临床终点事件对氯吡格雷的临床疗效进行评价。因此，相关大样本前瞻性的研究仍需进一步进行。

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The inf l uence of age and gender on the association between the genetic polymorphism of PON1 Q192R and the effect of clopidogrel

XU Xiao-yu, SHI Xiu-jin, XU Xi-qiao, PENG Wen-xing, LIN Yang
(Department of Pharmacy, Beijing Anzhen Hospital, Beijing 100029, China)

Objective: To investigate the association between the gene polymorphism of PON1 Q192R and the occurrence of clopidogrel resistance (CR) among different age groups and gender groups. Methods: A total of 1254 patients were enrolled. Detailed clinical information and genetypes of PON1 Q192R of each patient was collected. Platelet reactivity was measured with platelet aggregation rate (PAR) which was detected when continuously taking standard antiplatelet drugs more than 3 days. PAR ＞50% was def i ned as CR. The patients were divided into different grous based on their age and gender. Then the correlation of CR and PON1 Q192R in different groups was analyzed. Results: The minor allele frequency (MAF) in our study population was 37%. In PON1 Q192R mutant homozygous type (A/A) group, the rate of CR was 59.39%, which was signif i cantly higher than that of wildtype (G/G) group (43.58%) and mutant heterozygous type (G/A) group (49.00%) (P2 ＜ 0.01, P3 = 0.02 ＜ 0.05). In patients younger than or equal to 65 years old, the rate of CR in G/G group (41.69%) was signif i cantly different from that in A/A group (57.58%) (P2 = 0.00), while there was no signif i cant difference in the rate of CR among patients older than 65 years old (P1, P2, P3 ＞ 0.05). The rate of CR in male patients (45.87%) was signif i cantly lower than that in female patients (53.91%, P2 = 0.01). Moreover, in male patients, the rate of CR in G/G group (40.63%) was signif i cantly different from that in A/A group (57.02%, P2 ＜ 0.001), while there was no signif i cant difference in the rate of CR among female patients with different PON1 Q192R mutant type (P1, P2, P3 ＞ 0.05). Conclusion: Advanced age and femininity might be the independent risk factors of CR, which could weaken the inf l uence of PON1 Q192R on individual differences of clopidogrel treatment. The correlation of PON1 Q192R and CR was much more signif i cant in male patients younger than 65 years old.

Clopidogrel; PON1 Q192R; Age; Gender

R969.4

A

1672 – 8157(2017)03 – 0146 – 05

2017-02-09

2017-03-08）

“重大新药创制”科技重大专项课题（2012ZX09303016）

林阳，女，主任药师，研究方向：心血管药物的个体化治疗。E-mail：linyang3623@163.com

徐晓宇，女，硕士研究生，研究方向：临床药物基因组学。E-mail：xuxiaoyu1015@sina.com