清肺通络敷胸膏对流感病毒肺炎大鼠肺组织ERK/NF-κB p65蛋白表达的影响

刘双 ， 王雪峰， 郝欧美

实验论著

清肺通络敷胸膏对流感病毒肺炎大鼠肺组织ERK/NF-κB p65蛋白表达的影响

刘双 ， 王雪峰， 郝欧美

目的 探讨清肺通络膏对流感病毒诱导的肺炎大鼠肺组织中ERK/NF-κB p65信号通路的调控机制。方法 将30只Wister大鼠随机分为正常组、模型组、清肺通络敷胸膏组，每组10只。除正常组外，采用鼻腔接种流感病FM1株诱导Wister幼龄大鼠肺炎，在感染后各治疗组采用清肺通络膏贴敷于大鼠背部肺脏投影区治疗。观察各组大鼠的一般状态(饮食量、进水量、毛发、活动量、精神状态、呼吸频率)；光镜下观察肺组织形态学；采用免疫组织化学法检测各组大鼠肺组织磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)，核转录因子(NF-κB p65)的表达水平。结果 与正常组相比，模型组大鼠肺组织中p-ERK,NF-κB p65蛋白表达显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，清肺通络膏组p-ERK、NF-κB p65蛋白的表达较模型组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 清肺通络膏通过抑制ERK磷酸化，使NF-κB p65表达降低，从而减轻了肺组织的病理损伤，达到治疗目的。

肺炎； 流感病毒； 清肺通络膏； 细胞外调节蛋白激酶； 核转录因子p65； 大鼠

现代医学中的小儿肺炎是以发热、咳嗽、痰壅、气促、鼻煽为主要临床特征的急性肺损伤疾病[1-2]，归属于中医学喘息、肺家炎、肺风痰喘、火热喘急、风温肺热肺炎喘嗽等证的范畴。小儿肺炎喘嗽证无论是虚是实，从病因、病机、传变、证候特点都具以“热”“痰”“淤”“毒”为主要病理因素，始终贯穿于疾病的整个过程，因此应注重清热化淤、宣肺化痰，解毒[3-4]。由于流感病毒抗原变异频繁，西医以疫苗预防为主，同时，现存的抗流感病毒药物已产生耐药性和不良反应[5]。中草药资源丰富，可以多靶标、多途径发挥作用，在防治流感病毒方面，不良反应少，耐药性低等优点，而且还能抑制病毒复制、调节免疫功能、镇痛解热、改善血液循环、抗菌消炎等功效[6]。肺通络敷胸膏前期研究证明中药外用贴敷对于患儿咳嗽、咳痰、肺部湿啰音不易消退等症状和体征疗效显著[7-8]。流感是一种病毒传染性疾病，具有传染性强、传播速度快、人群反复易感等特点，严重威胁着人类健康，所以，抗流感病毒药物的开发仍是目前研究的重点。本研究通过建立流感病毒感染大鼠肺炎模型，探究清肺通络膏外敷治疗流感病毒感染的作用机制和时效关系，观察清肺通络膏对流感病毒感染后肺组织的保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及其分组 选取SPF级Wister幼龄大鼠30只，雌雄各半，体质量70～80 g，动物合格证号：SCXK(辽)2010-0001，购置于辽宁长生生物科技有限公司。将30只Wister大鼠按随机数字表法分为模型组、正常组、清肺通络敷胸膏组，每组10只。

1.1.2 病毒 甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1)，由中国预防医学科学院病毒研究所提供，冻存于辽宁中医药大学附属医院病毒实验室，培养传代后为FM1M9E2M1E3M2E4M1E5(经9日龄鸡胚尿囊腔接种)，测定血凝滴度为1∶640，测定其对大鼠的半数致死量(LD50)为8.46。

1.1.3 药物制备 清肺通络敷胸膏以大黄、黄芩作为君臣药，药物均购置于辽宁中医药大学中药局。按照一定的比例称取，实验的中药选择70%乙醇回流2次，分别提取2 h、1.5 h，每次乙醇体积均为所用药材的6倍。两次药液混合，减压风干为粉末避光保存，取粉末加水调成膏状备用。

1.1.4 试剂 p-ERK抗体试剂盒(美国abcam公司)，NF-κB p65抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，苏木精-伊红(HE)染色液，多聚甲醛。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 除正常组外，其他各组均造模，经鼻腔接种甲型流感病毒FM1株，建立流感病毒感染的大鼠肺炎模型，正常组接种等量的不含病毒的生理盐水，连续3 d。

1.2.2 给药 除了模型组和正常组外，清肺通络敷胸膏组于感染前，应用脱毛剂将大鼠背部脱光。用纱布涂上清肺通络膏缠背部，自接种流感病毒当天始，每日1次。

1.2.3 标本采集 于造模后第3、5、7天取材，取材前8 h禁食禁水，断颈处死，在无菌条件下取出整个肺脏，用无菌生理盐水冲洗2遍，取肺叶放于多聚甲醛中固定，用于病理学和免疫组织化学检测。

1.2.4 病理组织切片制作 将固定好的标本行石蜡包埋，切片，经HE染色、中性树胶封固后显微镜观察照相。1.2.5 免疫组织化学实验 肺组织p-ERK、NF-κB p65蛋白表达，采用免疫组织化学法，用 Image pro plus 5.1软件拍照并进行半定量分析。测其积分光密度值(IOD)。取平均值代表上述指标的表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态观察 正常组大鼠精神状态良好，反应灵敏，毛发光泽，呼吸均匀，饮食旺盛，大便正常，体质量自然增长。模型组见呼吸急促，行动迟缓，弓背，蜷缩抱团，毛发耸立欠光泽，食量和饮水量均减少，体质量减轻。

2.2 各组大鼠肺组织病理观察结果 大鼠肺组织HE染色结果显示，正常组肺泡、支气管形态结构完整，肺泡壁厚度正常，外周未见炎性细胞浸润(图1a，见封三)。模型组肺泡正常结构消失，肺泡上皮细胞脱落坏死、间质充血水肿，毛细血管扩张，可见大量淋巴细胞为主炎症细胞浸润(图1b，见封三)。第3天肺组织中肺泡、支气管肺泡壁厚度轻度肿胀，水肿，肺泡内管腔内见少量分泌物和炎性细胞浸润(图1c，见封三)。第5天肺组织中支气管管壁细胞严重充血水肿，并向支气管周围扩展，肺泡破裂，坏死(图1d，见封三)。第7天肺组织中支气管和肺泡上皮细胞水肿较轻，偶见有炎症细胞浸润(图1e，见封三)。

2.3 各组Wister大鼠肺组织中p-ERK和NF-κB p65蛋白表达水平比较 在造模后的3个时间点，清肺通络敷胸膏组大鼠肺组织中p-ERK蛋白的表达高于正常组，低于模型组；正常组低于模型组，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。清肺通络敷胸膏组大鼠肺组织中NF-κB p65蛋白的表达低于正常组和模型组；模型组低于正常组，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组Wister大鼠肺组织中p-ERK和NF-κB p65蛋白表达水平比较

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

各组大鼠肺组织中p-ERK蛋白的表达显示，在第3、5、7天大鼠肺组织免疫组织化学染色后均可观察到肺组织中存在有p-ERK棕黄色阳性颗粒，与正常组比较，模型组肺组织中阳性颗粒数目最多；第3、5、7天大鼠肺组织中的阳性颗粒数较少，以第7天减少最明显，见图2(见封三)。

各组大鼠肺组织中NF-κB p65蛋白表达显示，在第3、5、7天大鼠肺组织免疫组织化学染色后均可观察到肺组织中存在有NF-κB p65棕黄色阳性颗粒，与正常组比较，模型组肺组织中阳性颗粒数目最多；第3、5、7天大鼠肺组织中的阳性颗粒数较少，以第7天减少的最明显，见图3(见封三)。

3 讨论

流感病毒属于正黏病毒科病毒，依据其核蛋白抗原性的差异分成A、B、C三型，感染性和致病性等方面存在差异，其中以甲型流感病毒危害最大。流感病毒性肺炎归属于中医的肺炎喘嗽范畴，病机特点是以“热”“痰”“淤”“毒”多见，因此采用“通腑、降泄”的治疗方法泄腑热以清肺火。清肺通络敷胸膏是王雪峰教授依据《伤寒论》中承气汤的组方思想制作的外用的膏剂，秉承了中医“内病外治”的理论思想，有“釜底抽薪”之意。名医孙谨臣认为，凡肺炎喘嗽、哮喘、咳嗽等症因痰涎壅盛阻于气道者，皆可运用通腑之法。大黄味苦性寒，为君药，泻热逐淤，推陈出新，荡涤大肠以泻大肠腑实来驱除肺内热毒的目的，黄芩善清肺热，泻肺火，与大黄相伍，清上泻下，使邪热有出路，随便而解。贴敷疗法是根据中医“内病外治”的理论思想，采用中草药敷于相应的肌表治疗疾病的方法，同时还能通过穴位-经络的作用而发挥治疗作用。

流感病毒主要是通过空气传播侵入呼吸道黏膜，与宿主鼻、咽喉、肺部等组织细胞膜上的唾液酸受体相结合[9]。本实验中模型组大鼠幼龄的精神状态不佳，光镜下肺组织病理见肺泡融合断裂，肺泡壁增厚，部分坏死，大量炎症细胞浸润，肺间质水肿，并累及到支气管等，与相关文献报道一致[10-11]，说明大鼠感染流感病毒后，诱发了肺组织严重的炎症反应和病理损伤，提示造模成功。NF-κB是一种核转录因子，能够与因启动子部位的κB位点特异性结合，激活状态下进入细胞核并调控DNA的转录过程，参与机体免疫应答过程、炎症反应、细胞的生长等方面有重要作用[12]。有研究表明ERK通路上的P90-rsk激酶可以使NF-κB与抑制蛋白IκB分离，从而使NF-κB信号通路激活[13]。针对NF-κB通路在抗流感病毒治疗中发挥的作用已被证实可以通过降低病毒滴度和细胞因子的过度表达实现[14]。说明外界刺激激活了ERK1/2活化，核转录因子NF-κB作为ERK1/2非常重要的下游靶信号的传导分子，可以进一步激活NF-κB磷酸化及后续下游炎症细胞合成和释放，使炎症反应加重。

本实验采用免疫组织化学法检测不同时间点肺组织中ERK/NF-κB p65蛋白表达水平，与模型组相比，正常组和清肺通络敷胸膏组在各时间点肺组织中p-ERK、NF-κB p65蛋白表达明显少，说明清肺通络敷胸膏治疗病毒性肺炎的作用机制之一可能为通过调控ERK/NF-κB p65信号通路，减少了肺组织内炎症介子及细胞因子的合成和释放，减轻大鼠肺组织病理损伤。因此，清肺通络膏对流感病毒感染大鼠肺炎所致的病理损伤具有一定的保护作用，是治疗流感病毒感染的有效外用药。

[1] 汪受传.中医儿科学[M].北京:中国中医药出版社,2004:103.

[2] 王伟.细胞因子风暴在流感病毒诱导的急性肺损伤中作用机制的研究[D].北京：北京协和医学院中国医学科学院,2015.

[3] 王雪峰.从肺毒热论治小儿肺炎本脏重症[J].中医杂志,2012,53(3):200-202.

[4] 汪受传,艾军,赵霞.小儿肺炎从热、郁、痰、瘀论治研究[J].中国中西医结合儿科学,2009,1(1):29-32.

[5] 刘颂,王京燕.抗流感病毒药物的研究进展[J].国外医学:药学分册,2005,32(2):111-115.

[6] 杨殿福,徐泊文,郝钰.中药抗流感病毒机制研究进展[J].中国中医急症,2007,16(8):988-989.

[7] 刘晓婷.黄芩苷对流感病毒H1N1感染A549细胞的作用及免疫调控机制的研究[D].北京：北京中医药大学,2016.

[8] 张沂.疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒感染细胞的干预作用机制的研究[D].北京：北京中医药大学,2015.

[9] Ge H，Wang YF，Xu J，et al.Anti-influenza agents from traditional Chinese medicine[J].Nat Prod Rep,2010,27(12):1758-1780.

[10]Guarner J, Falcón-Escobedo R.Comparison of the pathology caused by H1N1,H5N1,and H3N2influenza viruses[J].Arch Med Res,2009,40(8):655-661.

[11]肖会敏,王四旺,王剑波，等.流感病毒致病特点及抗流感病毒中药活性成分与部位研究进展[J].亚太传统医药,2008,4(5):15-17.

[12]Shishodia S,Koul D,Aggarwal BB.Cyclooxygenase(COX)-2 in inhibitor celecoxib abrogates TNF-induced NF-kappa B activation through inhibition of activation of I kappa B alpha kinase and Akt in human non-small cell lung carcinoma：correlation with supp ression of COX-2 synthesis[J].J Immunol,2004,173(3)：2011-2022.

[13]Perkins ND.Integrating cell-signalling pathways with NF-kappa B and IKK function[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(1)：49-62.

[14]Viatour P， Merville MP,Bours V,et al.Phosphorylation of NF-kappa B and I kappa B proteins: implications in cancer and inflammation[J].Trends Biochem Sci，2005， 30(1)：43-52.

(本文编辑：吴迪)

Effect of Qingfei Tongluo ointment on the expression of ERK/NF-κB p65 protein in the lung tissues of rats with influenza virus pneumonia

LIUShuang，WANGXuefeng，HAOOumei.
LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China

Objective To investigate the mechanism of Qingfei Tongluo ointment in regulating the EPK/NF-κB p65 signal pathway in the lung tissues of rats with influenza virus pneumonia.Methods Thirty Wister rats were randomly divided into 3 groups: normal group(A), model group(B) and Qingfei Tongluo group(C), 10 rats in each group. Influenza virus FM1 strain was inoculated through nose to induce pneumonia in young Wister rats, in group B and C. After infection, Qingfei Tongluo ointment was applied to the projected area of lungs on the back of rats for treatment. The general state of all the rats were observed, including the amount of food and water taken, hair,exercise, mental state and breathing frequency. The morphology of lung tissues was observed under light microscope. The expression of NF-κB p65 and p-ERK was detected by immunohistochemical assay.Results Compared with group A, the expression of p-ERK and NF-κB p65 protein in the lung tissues of rats in group B was significantly increased, and the difference was statistical(P<0.05);the expression of p-ERK and NF-κB p65 in group C was significantly reduced compared with group B, and there was statistical difference(P<0.05).Conclusion Qingfei Tongluo ointment can reduce the expression NF-κB p65 through inhibiting the phosphorylation of ERK, thus alleviating the pathological damage of lung tissues and achieving the treatment effect.

Pneumonia; Influenza virus; Qingfei Tongluo ointment; p-ERK; NF-κB p65; Rat

国家自然科学基金项目(81273800)

110032 沈阳,辽宁中医药大学2014级中医儿科学专业研究生(刘双)；辽宁中医药大学附属医院儿科(王雪峰，郝欧美)

刘双(1989-)，女，辽宁中医药大学2014级硕士研究生在读。研究方向：病毒性疾病的中医药治疗

王雪峰，E-mail:lnzywxf@163.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.02.001

R37

A

1674-3865(2017)02-0093-04

2017-03-08)