比色法测定泰乐菌素发酵液油含量的研究

高宏伟 兰秀娟 牛春

摘要[目的]探讨一种泰乐菌素发酵液油含量测定方法。[方法]利用比色法测定泰乐菌素发酵液中的油含量。[结果]该法在油含量为0.6～6.6 g/L时呈良好的线性关系（R2=0.999 8），平均回收率为106.7%，相对标准偏差为1.02%。[结论]该法精密度好、准确性高，可用于泰乐菌素发酵液油含量的测定。

关键词泰乐菌素；比色法；油含量

中图分类号TQ92文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0006-02

Abstract[Objective] The aim was to explore a colorimetric method for determination of tylosin oil content. [Method] We determined tylosin fermentation broth oil content by colorimetric method. [Result] The method had a good linear relationship（R2=0.999 8） when the oil content was 0.6-6.6 g/L； the average recovery was 106.7%； and the relative standard deviation was 1.02%. [Conclusion] The improved colorimetric method has good precision and high accuracy， so it can be used for determination of tylosin fermentation broth oil content.

Key wordsTylosin；Colorimetric method；Oil content

泰乐菌素的发酵以油为主要碳源，在发酵过程中主要以补油来满足菌体对碳源的需求，油中的油酸、亚油酸经甲基化形成甲基油酸，它是泰乐菌素生物合成的前体物质，发酵液中油含量的高低对菌体的呼吸代谢和产物的合成有重要影响，含量低，不利于产物的合成，含量高，菌体不能完全利用，产生脂肪酸积累，pH下降，影响代谢[1]。因此，必须严格控制发酵液中的油含量。目前，泰乐菌素发酵中主要通过乙醚提取法测定发酵液中脂肪含量的方法控制油含量，该法测定结果受人为因素的影响大，测定结果不准确，不能很好地指导补油，另外，乙醚极易挥发、易燃易爆、毒性大，对人体有麻醉作用，污染环境[2]。

比色法是一种能够快速测定游离脂肪酸含量的有效方法，曾兆国等[3]利用该法测定莫能菌素发酵液中油含量，取得了很好的效果。刘永乐等[4]用分光光度法测定发酵液中液体脂肪的含量，其结果准确，操作简便、快速。笔者对该法进行了一定的改进，并测定了泰乐菌素发酵液中的油含量，旨在为泰乐菌素发酵液中油含量的严格控制提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂。油酸、异辛烷、吡啶、醋酸铜、氢氧化钾、无水乙醇、盐酸均为分析纯，油（发酵用）。

1.1.2主要仪器。TE612-L电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；MTV-100多管漩涡混合仪，上海之信仪器有限公司；TD25B低速自动平衡离心机，上海卢湘仪离心机有限公司；HHS电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司；UV1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.2方法

1.2.1试剂的配制。

1.2.1.10.25 mol/L乙醇制KOH溶液的制备。取14.0 g 氢氧化钾置于烧杯中，加适量无水乙醇溶解并定容至1 000 mL。

1.2.1.25.0%醋酸铜溶液的制备。取5.0 g醋酸铜，用纯化水溶解，过滤，并定容至100 mL，摇匀后，用吡啶调节pH为6.1～6.4。

1.2.1.33.0 mol/L盐酸溶液的制备。在1 000 mL烧杯中加入752 mL蒸馏水，再缓慢加入248 mL盐酸，搅拌，冷却。

1.2.1.41.5%油酸基准液的配制。称取1.5 g油酸于100 mL容量瓶中，用异辛烷溶解并定容，摇匀。

1.2.2脂肪酸测定流程。试样乙醇KOH溶液水解→定容无水乙醇离心HCl还原醋酸铜显色→测定。

1.2.3油酸基准液吸收曲线的测定。取11.0 mL 1.5%油酸基准液于25 mL 容量瓶中，用异辛烷定容，摇匀。吸取5.0 mL于25 mL比色管中，加入1.0 mL醋酸铜溶液，旋涡振荡90 s后，静置20 s，以异辛烷为空白，在650～750 nm波长内每隔10 nm测量1次，在最大吸收处每隔5 nm测1次，以波长λ为横坐标，OD值为纵坐标绘制吸收曲线。

1.2.4油酸基准液标准曲线的测定。分别取1.5%油酸基准液1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00 mL置于25 mL 容量瓶中，用异辛烷定容，摇匀，得到0.60、1.80、3.00、4.20、5.40、6.60 g/L系列浓度油酸溶液。每种浓度的溶液各吸取5.00 mL于25 mL比色管中，加入1.00 mL醋酸铜溶液，旋渦振荡90 s，静置20 s，以异辛烷为空白，测定有机系OD值，以OD值为横坐标，油酸基准液浓度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5发酵液油含量测定。称取1.5～2.5 g发酵液于25 mL比色管中，加入6 mL 0.25 mol/L乙醇制KOH溶液摇匀，于60～80 ℃水浴中水解20 min（每隔5 min振荡1 min），水解完全，冷却后，用无水乙醇定容至10 mL，摇匀后3 000 r/min离心10 min，取用无水乙醇适当稀释后的上清液5.0 mL于25 mL比色管中，加3 mol/L盐酸溶液10.0 mL，摇匀，再加异辛烷5.0 mL，充分振荡提取5 min，静置1 min，取上层有机溶液2.0 mL于10 mL比色管中，加3.0 mL异辛烷，混匀后加1.0 mL醋酸铜显色剂，振荡90 s，靜置20 s，用异辛烷做空白测定有机系OD值，以标准曲线回归方程油含量。

油含量（g/100 g）=（5.396 6A+0.004 3）×稀釋倍数1V×A

式中，V为吸取萃取上清液体积（mL）；A为称取发酵液的质量（g）。

1.2.6水解时间的测定。称取0.30 g油加水至2.00 g，加入6 mL 0.25 mol/L乙醇制KOH溶液，于70 ℃水解5、10、15、20、25、30 min，按“1.2.4”的方法進行测定，以水解时间为横坐标，OD值为纵坐标作图。

2结果与分析

2.1油酸基准液吸收曲线由图1可知，当波长λ为700 nm时，达到最大吸收。因此，可确定最大吸收波长为700 nm。

2.2油酸基准液标准曲线由图2可知，回归方程为y=5.396 6x+0.004 3，相关系数R2=0.999 8。结果表明，油含量在0.6～6.6 g/L时有良好的线性关系。

2.3水解时间由图3可知，当水解时间达20 min时，吸光值达到最大且基本不变。

2.4精密度对同一样品按“1.2.5”的方法测定5个平行样。结果表明，该方法有较高的精密度和重复性，相对标准偏差（RSD）为1.02%。

2.5加样回收率分别称取发酵液1.5～2.5 g于6支25 mL比色管中，在其中的5支比色管中加入0.1 g油，按“1.2.5”的方法进行测定，计算回收率。计算公式：加样回收率=（A-B）/C×100%，其中A为加油样油含量（mg/g）；B为发酵液油含量（mg/g）；C为加油量/发酵液重量（mg/g）。由表1可知，该方法有较高的回收率，平均加样回收率为106.7%。

3结论

采用分光光度法测定发酵液中的残油含量具有以下特点：①试验所需检测设备简单。②灵敏度高，可检测0.6～6.6 g/L的油含量。③精密度好，准确度高，样品回收率高。④分析速度快，能够及时、快速、准确地反映出发酵液中的油含量，为泰乐菌素发酵过程中油的控制提供参数，一般可在1.5 h内完成。因此，该测定方法可用于泰乐菌素发酵生产过程中油含量的测定[5-6]。

参考文献

[1] 甘士喜，廖锦秀，张立红，等.泰乐菌素组份转化机制的研究[J].中国兽药杂志，2000，34（4）：22-24.

[2] 张琪，华惠敏，刘永衡，等.有机氮源对泰乐菌素发酵生产影响的研究[J].粮食与饲料工业，2013，12（11）：43-46.

[3] 曾兆国，李成梅，胡秀珍.分光光度法测定莫能菌素发酵液中油含量[J].养殖与饲料，2008（4）：105-106.

[4] 刘永乐，焦娜，黄寿恩，等.用分光光度法测定发酵液中液体脂肪的含量[J].食品工业科技，2004，25（5）：127-128.

[5] 余雯静.食品中脂肪含量的分析[J].苏州大学学报（工科版），2002，22（5）：95-98.

[6] 俞一夫.国内外粮食、油料脂肪测定方法评析[J].西部粮油科技，2000，25（1）：46-48.