基于碳量子点荧光恢复的三聚氰胺测定方法

苏安梅， 余姝轶， 覃 秀， 沈彦伶， 钟青梅， 王益林

(广西大学化学化工学院 广西生物炼制重点实验室， 广西 南宁 530004)

基于碳量子点荧光恢复的三聚氰胺测定方法

苏安梅， 余姝轶， 覃 秀， 沈彦伶， 钟青梅， 王益林*

(广西大学化学化工学院 广西生物炼制重点实验室， 广西 南宁 530004)

在碳量子点溶液中加入汞离子，量子点的荧光被猝灭，加入三聚氰胺后荧光恢复。据此，建立了基于碳量子点荧光恢复测定三聚氰胺的新方法并应用于实际样品的分析。研究结果表明，在汞离子和碳量子点浓度之比为15∶10000且碳量子点浓度为4.0 g/L、pH值为7.5的实验条件下，方法的线性范围为3.0～60.0 mg/L，检出限(3σ/k)为2.2 mg/L。方法应用于实际样品测定时，其回收率为95%～103%。

碳量子点； 荧光恢复； 测定； 三聚氰胺

1 引 言

三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。作为一种化工原料，最常见的用途是和甲醛作用生成耐高温的树脂材料[1]。但因含氮量高(66.6%)，白色无味，所以没有简单的检测方法。在不法分子眼中，三聚氰胺是理想的食品和饲料中蛋白质的冒充物。然而，三聚氰胺进入体内后不能被代谢，而是从尿液中排出。动物实验也表明，长期食用三聚氰胺会产生以三聚氰胺为主要成分的肾结石和膀胱结石，因此，三聚氰胺对身体有害，不可用于食品添加物。自2008年以来，人们开始关注食品和动物饲料中三聚氰胺含量的检测，其主要方法有气质联用法[2]、酶联免疫法[3]、拉曼光谱法[4]、电化学法[5]、红外光谱法[6]和荧光光谱法[7]等。

碳量子点是一种新型荧光纳米材料[8]，基于碳量子点的荧光猝灭分析法已应用于无机金属离子[9-14]和有机物[15-16]的定量测定。此外，碳量子点具有低的细胞毒性和良好的生物相容性，近年来，基于碳量子点荧光恢复的分析方法已应用于葡萄糖[17]、抗坏血酸[18]、多巴胺[19]、半胱氨酸[20]、碱性磷酸酶[21]和去铁铁蛋白[22]等的分析检测。本文以柠檬酸为碳源合成碳量子点，在合成的碳量子点中加入Hg2+使其荧光猝灭，再在体系中加入三聚氰胺溶液，碳量子点的荧光恢复，且三聚氰胺的浓度越高，荧光恢复程度越强。据此我们建立了一种基于碳量子点荧光恢复的三聚氰胺测定新方法。

2 实 验

2.1 主要试剂与仪器

三聚氰胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氯化高汞(分析纯，贵州省铜仁汞矿化学试剂厂)；柠檬酸(分析纯，广州化学试剂厂)；磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、三氯乙酸、乙腈(分析纯，广东光华科技股份有限公司)；氢氧化钠(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)。

RF-5301荧光分光光度计(日本岛津)；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；KQ-50DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；78-1磁力加热搅拌器(金坛市双捷实验仪器厂)； H1850离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

2.2 实验方法

2.2.1 碳量子点的制备

碳量子点的制备参照文献[23]方法进行：称取4.0 g的柠檬酸于烧杯中，并放入已升温至200 ℃的干燥箱中加热20 min，取出后用1.0 mol/L NaOH溶液将其pH值调至7.0，然后转移到200 mL容量瓶中并定容，得到20 g/L的碳量子点溶液(按柠檬酸计算)。

2.2.2 三聚氰胺的测定

在系列10 mL比色管中依次加入5.0 mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH=7.5)、2.0 mL碳量子点、48 μL Hg2+离子标准溶液(浓度为1.25 g/L)和不同体积的三聚氰胺标准溶液(浓度为3.0 g/L)，充分混匀后用去离子水定容至刻度，用RF-5301型荧光分光光度计测荧光强度(F)。同时做三聚氰胺试剂空白(F0)。测定时，激发波长选用370 nm，激发和发射狭缝都设置为5.0 nm。

3 结果与讨论

3.1 测定原理

汞离子结合于碳量子点表面后，直接从光激发的碳量子点的导带吸收电子，从而导致激发态电子不能有效回到价带，即发生电荷转移而使碳量子点荧光猝灭[12]。若能使汞离子脱离碳量子点表面，则导带中的激发态电子能有效返回到价带，其荧光即可恢复(图1)。

图1 测定原理示意图

由软硬酸碱理论可知，三聚氰胺分子中的氨基能与汞离子形成较强的配位键，可将结合于碳量子点表面的汞离子“拉”下来。图2数据表明，在370 nm光的激发下，碳量子点在460 nm处有强荧光；加入汞离子后，量子点荧光发生猝灭；继续加入三聚氰胺，碳量子点的荧光又恢复。据此，可以建立一种碳量子点荧光恢复测定三聚氰胺的分析方法。

图2 碳量子点-汞离子-三聚氰胺体系的荧光光谱

3.2 测定条件的选择

图3是Hg2+离子浓度对碳量子点的荧光光谱的影响。在pH值为8.0的缓冲溶液中，在1.0 g/L的碳量子点溶液中加入Hg2+后，量子点的荧光发生猝灭，并且荧光猝灭程度随Hg2+离子浓度的增大而增强。当Hg2+浓度为2.5 mg/L时，碳量子点的荧光猝灭程度为86.8%。进一步研究表明，Hg2+浓度较高时，体系对三聚氰胺检测的灵敏度较低，故本实验选取猝灭程度为71.4%时的Hg2+浓度(1.5 mg/L)，即Hg2+浓度和碳量子点浓度之比为15∶10000为实验条件。

图3 碳量子点在不同浓度Hg2+溶液中(0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.2, 1.3, 1.5, 1.8, 2.5, 3.0 mg/L)的荧光光谱

Fig.3 Fluorescence emission spectra of the CQDs in aqueous solution upon addition of various concentrations of Hg2+(0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.2, 1.3, 1.5, 1.8, 2.5, 3.0 mg/L)

图4是不同pH值条件下，碳量子点-Hg2+以及碳量子点-Hg2+-三聚氰胺体系的荧光强度，其中碳量子点浓度为1.0 g/L，Hg2+浓度为1.5 mg/L，三聚氰胺浓度为60.0 mg/L。可以看出，随着pH值的升高，二者的荧光强度整体呈上升趋势。当pH为7.5时，二者的荧光响应较强，且荧光恢复程度大。后续实验选择在pH=7.5的缓冲体系中进行。

图4 不同pH值下碳量子点的荧光强度

图5是碳量子点浓度对荧光恢复的影响。在选定的Hg2+浓度和碳量子点浓度之比条件下，在pH=7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中改变碳量子点的浓度，加入相同的浓度为16.0 mg/L的三聚氰胺。实验表明，当碳量子点浓度增加时，碳量子点-Hg2+、碳量子点-Hg2+-三聚氰胺体系的荧光均有所增强，且在碳量子点浓度为4.0 g/L时荧光恢复程度最大。故后续实验选取碳量子点浓度为4.0 g/L。

图5 碳量子点的浓度对荧光响应的影响

Fig.5 Fluorescence intensity of CQDs with different concentrations

图6是碳量子点-Hg2+以及碳量子点-Hg2+-三聚氰胺体系在不同时间的荧光强度，其中碳量子点的浓度为4.0 g/L，Hg2+浓度为6.0 mg/L，三聚氰胺浓度为16.0 mg/L，pH值为7.5。数据表明，在20～60 min内，二者的荧光强度值保持稳定。故后续实验选择在混匀20 min后进行荧光测定，并在60 min内完成全部测定。

图6 反应时间对荧光强度的影响

3.3 三聚氰胺的测定

3.3.1 标准曲线和检出限

在选定的实验条件下，改变三聚氰胺标准溶液的浓度，对碳量子点-Hg2+-三聚氰胺体系进行荧光测定。结果表明，随着三聚氰胺的加入，碳量子点的最大荧光发射波长不变，但荧光强度随三聚氰胺浓度的增加而增大。进一步研究表明，碳量子点的荧光恢复程度((F-F0)/F0)与三聚氰胺浓度在3.0～60.0 mg/L范围内呈良好的线性关系(图7)，线性回归方程为(F-F0)/F0=0.0287C+0.0456 (C为三聚氰胺的浓度，单位：mg/L)，相关系数为0.994，方法检出限(3σ/k)为2.2 mg/L。

图7 碳量子点的荧光强度随三聚氰胺浓度(0, 3.0, 6.0, 12.0, 15.0, 21.0, 27.0, 30.0, 36.0, 42.0, 60.0 mg/L)的变化。插图：(F-F0)/F0与三聚氰胺的浓度在3.0～60.0 mg/L范围内呈良好的线性关系。

Fig.7 Dependence of FL intensity on the concentration of melamine(0, 3.0, 6.0, 12.0, 15.0, 21.0, 27.0, 30.0, 36.0, 42.0, 60.0 mg/L). Inset shows the linear relationship between (F-F0)/F0and melamine concentration within the range of 3.0-60.0 mg/L.

3.3.2 共存物的影响

实验进行了在实际样品测定中可能出现的干扰物对三聚氰胺测定结果的影响。当三聚氰胺的浓度为60.0 mg/L时，考察了10倍浓度的共存物对被测物分析结果的影响，这些共存物分别为：K+、Mg2+、Na+、Ca2+、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、葡萄糖(Glu)和乳糖(Lac)。图8数据表明，在加入共存物后，碳量子点-Hg2+-三聚氰胺体系的荧光强度值没有发生明显的变化，测定结果相对误差均在±5%的范围内，表明该方法的选择性好。

图8 以三聚氰胺体系荧光值作为对照，加入各干扰体系后荧光响应的相应柱状图。

Fig.8 Corresponding bar chart of the fluorescence responses of adding interference system obtained with the use of a sensor for melamine (control)

3.3.3 分析应用

称取2.50 g纯牛奶4份，分别加入不同量的三聚氰胺(0, 5.0, 20.0, 50.0 mg)、15 mL三氯乙酸(10.0 g/L)及5 mL乙腈。然后，对样品依次进行如下处理：15 min的超声、10 min的振荡、10 min的离心(转速：9 500 r/min)。将上清液透过0.45 μm的滤膜后，用NaOH溶液调其pH值至7.0，转入250 mL容量瓶中并定容。取2.00 mL定容后的溶液按实验方法进行测定。同时作工作曲线，根据工作曲线求得各试液中三聚氰胺的浓度，并进一步计算回收率，具体数据见表1。结果表明，所测样品中没有检测到三聚氰胺，加标回收率在95%～103%范围内，说明该方法的准确度较高，可应用于实际样品的测定。

表1 纯牛奶中三聚氰胺的测定结果

4 结 论

以柠檬酸为碳源合成水溶性碳量子点。Hg2+离子结合于碳量子点表面后能猝灭其荧光，而三聚氰胺中氨基与Hg2+离子形成更稳定的配位键，将Hg2+离子带离碳量子点表面从而使荧光恢复。据此，建立了一种基于碳量子点荧光恢复测定三聚氰胺的分析方法，并应用于实际样品中的测定，方法的各项分析性能满足微量分析的要求。

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苏安梅(1992-)，女，广西百色人，硕士研究生，2015年于广西大学获得学士学位，主要从事量子点荧光材料的合成与应用的研究。

E-mail: 962240842@qq.com

王益林(1968-)，男，湖南邵阳人，博士，副教授，2010年于广西大学获得博士学位，主要从事量子点荧光材料的合成与应用的研究。

E-mail: theanalyst@163.com

Determination of Melamine Based on Fluorescence Recovery of Carbon Quantum Dots

SU An-mei, YU Shu-yi, QIN Xiu, SHEN Yan-ling, ZHONG Qing-mei, WANG Yi-lin*

(Guangxi Key Laboratory of Biorefinery, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China)

*Corresponding Author, E-mail: theanalyst@163.com

We report a method for determination of melamine based on fluorescence recovery of carbon quantum dots (CQDs). It was found that the fluorescence intensity of CQDs can be efficiently quenched by Hg2+. And a turn-on fluorescence signal can be observed if melamine was added. The results showed when the concentration ratio of mercury ions to carbon quantum dots was 15∶10000, the concentration of carbon quantum dots was 4.0 g/L and the pH value was 7.5, the response was linearly proportional to the concentration of melamine within the range of 3.0-60 mg/L, the limit of detection (3σ/k) was 2.2 mg/L. The method was successfully applied to the determination of melamine in real sample with satisfactory recoveries (95%-103%)

carbon quantum dots; fluorescence recovery; determination; melamine

1000-7032(2017)07-0967-06

2016-12-13；

2017-02-10

广西自然科学基金(2014GXNSFAA118328)； 广西生物炼制重点实验室开放基金(GXKLB-2)； 广西大学大学生创新创业训练计划(201610593162)资助项目 Supported by Natural Science Foundation of Guangxi(2014GXNSFAA118328); Opening Project of Guangxi Key Laboratory of Biorefinery(GXKLB-2); Foundation of College Student Experimental Skills and Innovation Ability Training of Guangxi University(201610593162)

O611.4

A

10.3788/fgxb20173807.0967