龙须菜多酚提取工艺优化及其体外抗氧化活性

陈洪彬 - 杨 敏 宋露露 - 董 乐

(1. 泉州师范学院海洋与食品学院，福建 泉州 362002；2. 福建省海洋藻类活性物质与功能开发重点实验室，福建 泉州 362002)

龙须菜多酚提取工艺优化及其体外抗氧化活性

陈洪彬1,2CHENHong-bin1,2杨 敏1YANGMin1宋露露1SONGLu-lu1董 乐1,2DONGLe1,2

(1. 泉州师范学院海洋与食品学院，福建 泉州 362002；2. 福建省海洋藻类活性物质与功能开发重点实验室，福建 泉州 362002)

以龙须菜为原料，研究超声波辅助提取龙须菜多酚的工艺条件及其抗氧化活性。单因素考察液料比、提取温度、超声时间对龙须菜多酚含量的影响，在此基础上，利用响应面分析法优化提取工艺。结果表明，液料比40∶1 (mL/g)、提取温度60 ℃、超声时间40 min为龙须菜多酚提取最佳工艺条件(龙须菜多酚提取量为1.62 mg GAE/g)。体外抗氧化活性研究表明，龙须菜多酚具有一定清除DPPH自由基和羟自由基的能力，其IC50值分别为56.67，18.78 μg/mL，分别相当于15.89，536.4 μg/mL的抗坏血酸。

龙须菜；多酚；超声波辅助；抗氧化活性

龙须菜(Gracilarialemaneiformis)属红藻门江蓠属，是中国重要的大型养殖经济海藻，在中国福建、广东、浙江、山东、辽宁等沿海地区大量养殖，其中福建养殖量占全国养殖总量一半以上[1]。龙须菜含有丰富的蛋白质和碳水化合物，是制备琼胶的重要原料，也是鲍鱼等水产养殖的主要饵料之一[2-4]。近年来，有关龙须菜的研究大多集中在糖类方面[5-6]，如龙须菜多糖、龙须菜寡糖以及利用龙须菜来制备琼脂等，尤其是对制备琼脂的龙须菜，其加工的副产物有待进一步开发利用，以期实现琼脂清洁生产。海藻多酚是海藻植物中所含多酚类化合物的总称，多为间苯三酚衍生物和聚合物，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤及调节免疫机能等多种生理活性和药用功能[7-8]。目前，有关海藻多酚研究主要集中在褐藻多酚，如海带[9]、羊栖菜[10]、鼠尾藻[11]等褐藻中多酚类物质的提取、分离及生物活性研究，而有关红藻多酚的相关研究较少，仅在紫菜多酚的提取及应用方面有初步研究报道[12-15]，在龙须菜多酚的提取工艺优化方面的研究缺乏。裘晨阳等[15]虽然对龙须菜多酚的抗氧化活性进行测定，但其萃取的多酚未经大孔树脂纯化，杂质相对较多，抗氧化评价也不够深入。福建拥有丰富的龙须菜资源，很有必要对其含有的多酚进行研究，较系统地评价其体外抗氧化活性，以提高龙须菜资源的利用率。提取海藻多酚主要方式有溶剂浸提[10]、微波辅助[9,12]、超声波辅助[11,13-14]等方法，其中超声波辅助法在提取活性物质方面的应用较广泛，能有效提高提取率[16]。因此，利用超声波辅助提取龙须菜以提高多酚的得率具有可行性。本研究拟以福建莆田沿海养殖的龙须菜为原料，在预试验的基础上，以70%乙醇为提取溶剂，考察液料比、提取温度、超声时间对龙须菜多酚含量的影响，通过响应面分析法优化超声波辅助提取龙须菜多酚的工艺参数；在最优提取工艺下制备龙须菜粗多酚，再经大孔树脂纯化，以抗坏血酸为阳性对照，用DPPH自由基和羟自由基清除率较为系统地评价龙须菜多酚的体外抗氧化能力，旨在为龙须菜高值化利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

龙须菜：采自福建省莆田市平海镇某龙须菜养殖厂，烘干粉碎后备用；

紫外可见分光光度计：T6型，北京普析通用仪器有限责任公司；

精密天平：CP213型，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

超声波清洗器：KQ-200VDE型，昆山市超声仪器有限公司；

高速冷冻离心机：GL-20G-II型，上海安亭科学仪器厂；

恒温水浴锅：HH-4型，常州国华电器有限公司；

鼓风干燥箱：DHG-9246A型，上海精宏实验设备有限公司；

万能粉碎机：ZN-02型，北京兴时利仪器有限公司；

1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)：分析纯，东京化成工业株式会社；

没食子酸、福林酚、抗坏血酸、邻二氮菲、硫酸亚铁等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 龙须菜多酚的提取

龙须菜粉→过80目筛→超声辅助提取→离心(4 000 r/min，20 min)→龙须菜多酚提取液

1.2.2 多酚含量的测定 参考李颖畅等[13]的方法，用福林酚法测定提取液中多酚的含量，以没食子酸计，y=0.013 1x-0.004 8(R2=0.999 5)为标准曲线方程，并根据标准曲线计算出多酚的含量，用mg GAE/g表示。

1.2.3 龙须菜多酚抗氧化活性的测定

(1) DPPH自由基清除能力测定：参照文献[1]。

(2) 羟基自由基清除能力测定：采用邻二氮菲法[1]。

(3)IC50：指DPPH自由基清除率、羟自由基清除率为50%时所需多酚溶液的浓度。以多酚浓度(mg/mL)为自变量，抗氧化活性指标(%)为因变量进行一次或二次曲线拟合，根据拟合方程计算IC50。

1.2.4 单因素试验设计

(1) 液料比：在提取温度60 ℃，超声时间40 min的条件下，分别考察液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1(mL/g)] 对龙须菜多酚含量的影响，重复3次，取平均值。

(2) 提取温度：在液料比40∶1 (mL/g)，超声时间40 min的条件下，分别考察提取温度(30，40，50，60，70 ℃)对龙须菜多酚含量的影响，重复3次，取平均值。

(3) 超声时间：在液料比40∶1 (mL/g)，提取温度60 ℃的条件下，分别考察超声时间(10，20，30，40，50 min)对龙须菜多酚含量的影响，重复3次，取平均值。

1.2.5 龙须菜多酚提取工艺的响应面法优化 采用Central Composite Design响应面优化分析法，结合单因素试验的结果，考察液料比、提取温度、超声时间对龙须菜多酚含量的影响，根据试验结果确定最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 液料比对龙须菜多酚含量的影响 由图1可知，在液料比为40∶1 (mL/g)时，龙须菜多酚的含量达到最大值，为1.63 mg GAE/g。当液料比超过40∶1 (mL/g)时，龙须菜多酚的含量趋于平稳。说明此时龙须菜多酚的溶出量已基本饱和，再增加溶剂的量，无法增加龙须菜多酚的含量，同时过高的液料比将增加乙醇用量，增加浓缩负荷，成本也大幅度增加。这与李颖畅等[13]对紫菜多酚提取的研究结果相似。

图1 液料比对龙须菜多酚含量的影响

Figure 1 Effects of liquid-material ratio on the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformis

2.1.2 提取温度对龙须菜多酚含量的影响 由图2可知，在30～60 ℃时，龙须菜多酚的含量随温度的增加而逐渐升高，到60 ℃时，龙须菜多酚含量达到最大值(1.51 mg GAE/g)，之后龙须菜多酚含量有所下降。随着温度升高，龙须菜多酚提取液黏度下降，分子间运动加剧，氢键更易断裂，溶解、扩散速度更快，龙须菜多酚类物质更易溶出。但温度过高，多酚易发生氧化或降解等一些不可逆反应，破坏龙须菜多酚的结构，从而降低其提取量。这与吕成林等[10]对羊栖菜多酚的研究结果相似。

图2 提取温度对龙须菜多酚含量的影响

Figure 2 Effects of extract temperature on the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformis

2.1.3 超声时间对龙须菜多酚含量的影响 由图3可知，随着超声时间的增加，龙须菜浸出的多酚含量也不断提高，在超声时间为40 min时，龙须菜多酚含量达到最大值，为1.63 mg GAE/g，之后龙须菜多酚含量略有下降。说明超声40 min后，龙须菜多酚已基本溶出，再增加超声时间不仅无法增加其含量，还会破坏龙须菜多酚的结构，从而降低其提取量。

图3 超声时间对龙须菜多酚含量的影响

Figure 3 Effects of ultrasonic times on the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformis

2.2 响应面法优化结果与分析

2.2.1 响应面试验设计与结果 试验因素水平表见表1，试验设计与结果见表2。

对响应面试验的结果进行分析，可得以龙须菜多酚含量(Y)为响应值的回归方程：

Y=-3.074 03+0.125 4A+0.085 22B+0.076 52C+2.883 6×10-4AB-9.994×10-5AC-2.197 2×10-4BC-2.86×10-4A2-6.808 1×10-4B2-6.759 5×10-4C2。

(1)

进一步分析可知，A、B、C、A2、B2和C2项对龙须菜多酚含量的影响极显著(P<0.01)，AB和BC项对龙须菜多酚的影响显著(P<0.05)，AC项对龙须菜多酚的影响不显著(P>0.05)。

表2 龙须菜多酚提取响应面试验设计及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

表3 方差分析†Table 3 ANOVA of the constructed regression model

2.2.2 响应面试验因素间的相互影响 进一步分析表3可知，液料比与提取温度的交互项和提取温度与超声时间的交互项对龙须菜多酚浸出的含量影响显著(P<0.05)，并对其作响应曲面图和等高线图(图4、5)。响应曲面的平缓和陡峭程度可以反映因素值变化对响应值的影响大小，若曲面坡度平缓，则因素值的变化对响应值影响较小；反之，则影响较大。等高线的形状可以反映出两因素间交互作用的强弱，椭圆扁平程度表示两因素的交互作用强弱，越扁平说明相互作用越强。由图4可知，液料比和提取温度之间的等高线形状呈椭圆形，响应曲面坡度非常陡峭，等高线图也较扁平，说明液料比和提取温度间的交互作用较强，对龙须菜多酚含量的影响大。

图4 液料比和提取温度对龙须菜多酚含量的交互作用Figure 4 Interaction effects of liquid-material ratio and extract temperature on the contents of polyphenols

图5 提取温度和超声时间对龙须菜多酚含量的交互作用Figure 5 Interaction effects of extract temperature and ultrasonic times on the contents of polyphenols

2.2.3 最佳工艺参数的确定及验证性试验 对式(1)进一步分析可知，理论超声辅助提取龙须菜多酚的最佳参数条件为：液料比47.72∶1 (mL/g)、提取温度65.86 ℃、超声时间42.37 min。根据实际可操作情况，修正最佳提取工艺条件为：液料比48∶1 (mL/g)、提取温度66 ℃、超声时间42 min，并进行验证性实验(n=3)，得到龙须菜多酚含量为(1.58±0.07) mg GAE/g，与中心试验组条件下获得的龙须菜多酚含量(1.62±0.02) mg GAE/g相比较低，其理论最佳参数并非提取的最优条件。因此，在本试验中，超声辅助提取龙须菜多酚的最优工艺条件为：液料比40∶1 (mL/g)、提取温度60 ℃、超声时间40 min。

2.2.4 抗氧化活性评价 制备一定量的龙须菜多酚提取液，用大孔树脂初步纯化，得龙须菜粗多酚，浓度为0.104 mg/mL。由图6可知，经初步纯化后的龙须菜多酚具有一定的抗氧化活性。随着多酚浓度的增加，其DPPH自由基清除率和羟自由基清除率均增大，并且呈现明显的剂量效应关系。对其效应关系进行回归拟合，根据拟合方程计算IC50值，以抗坏血酸为阳性对照(图7)，结果见表4。由表4可知，龙须菜多酚的DPPH自由基清除率IC50为56.67 μg/mL，相当于15.89 μg/mL的抗坏血酸；龙须菜多酚的羟自由基清除率IC50为18.78 μg/mL，相当于536.4 μg/mL的抗坏血酸。因此，该试验制备的龙须菜粗多酚清除DPPH自由基能力略弱于同浓度下的抗坏血酸，而清除羟自由基的能力强于同浓度下的抗坏血酸。

3 结论

(1) 龙须菜多酚提取的最佳工艺条件为：液料比40∶1(mL/g)、提取温度60 ℃、超声时间40 min，在此条件下提取的龙须菜多酚含量为(1.62±0.02) mg GAE/g。

图6 多酚浓度对DPPH自由基和羟自由基的影响Figure 6 Effects of scavenging DPPH free radical and hydroxy free radical on the concentration of polyphenols preparing by Gracilaria lemaneiformis

图7 抗坏血酸浓度对DPPH自由基和羟自由基的影响Figure 7 Effects of scavenging DPPH free radical and hydroxy free radical on the concentration of ascorbic acid表4 龙须菜多酚和抗坏血酸对DPPH自由基、羟自由基的IC50值Table 4 IC50 values of polyphenols from Gracilaria lemaneiformis and ascorbic acid for DPPH free radical, hydroxy free radical

评价指标抗氧化剂回归方程R2IC50/(μg·mL-1)DPPH自由基龙须菜多酚y=0.003x+0.3270.99956.67抗坏血酸 y=-0.059x2+5.547x-23.260.99915.89羟自由基 龙须菜多酚y=0.018x+0.1620.98318.78抗坏血酸 y=0.000038x2+0.0835x-5.63790.991536.40

(2) 体外抗氧化活性研究表明，龙须菜多酚具有一定抗氧化活性，能有效清除DPPH自由基和羟自由基，其IC50值分别为56.67，18.78 μg/mL，分别相当于15.89，536.4 μg/mL的抗坏血酸。

(3) 本研究不足之处在于对龙须菜多酚的抗氧化评价为体外化学抗氧化，下一步需采用细胞抗氧化试验和体内小鼠试验对龙须菜多酚进行抗氧化评价。

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Optimizationon extraction of polyphenols and its antioxidant activityinVitrofromGracilarialemaneiformis

(1.CollegeofOceanologyandFoodSciences,QuanzhouNormalUniversity,Quanzhou,Fujian362002,China;2.FujianProvinceKeyLaboratoryfortheDevelopmentofBioactiveMaterialfromMarineAlgae,Quanzhou,Fujian362002,China)

Optimization of the ultrasonic-assisted extraction of polyphenols and its antioxidant activityinVitrofromGracilarialemaneiformiswere studied. The effects of liquid-material ratio, extract temperature, ultrasonic times on the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformiswere investigated. Based on this, the response surface analysis method was applied to determine the optimization of the extraction. Results showed that the optimum condition for the ultrasonic-assisted extraction of polyphenols weres as followed: ratio of liquid-material 40∶1 (mL/g), extraction temperature 60 ℃, ultrasonic times 40 min. Under the optimum condition, the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformiswas 1.62 mg GAE/g. Research of its antioxidant activityinvitroshows that the polyphenols fromGracilarialemaneiformishave scavenging capabilities of DPPH free radical and hydroxyl free radical, and theirIC50are 56.67 and 18.78 μg/mL, equivalent to 15.89 and 536.4 μg/mL of ascorbic acid.

Gracilarialemaneiformis; polyphenols; ultrasonic-assisted; antioxidant activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.027