酸性环境诱导肝癌HepG2细胞EMT

周春芳 赵珊珊 孙泽群 吴 军 查火龙 袁雅红

酸性环境诱导肝癌HepG2细胞EMT

周春芳1赵珊珊2孙泽群1吴 军1查火龙1袁雅红2

目的 研究酸性环境对肝癌HepG2细胞上皮细胞间质转化(EMT)的影响。方法 分别在酸性和碱性条件下培养HepG2细胞，观察细胞形态的区别。划痕实验检测两组细胞的迁移能力，Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭能力。RT-PCR检测两组细胞EMT相关基因mRNA的表达水平，Western blot检测两组细胞EMT相关基因蛋白的表达水平。结果 酸性条件下培养的HepG2细胞形态明显从上皮型转变为间质型；酸性条件下HepG2细胞的迁移能力明显强于碱性条件下；酸性条件下HepG2细胞穿越Matrigel的数量明显多于碱性条件下；酸性条件下HepG2细胞EMT相关基因Vimentin、Slug、Snail及Zeb1的mRNA表达以及EMT相关蛋白Vimentin和MMP9的表达强度均明显高于碱性条件下。结论 酸性环境能诱导肝癌HepG2细胞EMT的发生。

酸性环境；上皮间质转化；肝癌；HepG2

我国是原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)发病率最高的国家之一。HCC恶性度高，生长快速，术后5年内复发率高达50%～70%。而HCC的高侵袭性和肝内和(或)肝外转移是导致这种现象出现的主要原因[1]。因此，研究HCC迁移侵袭的发生机制对于提高肝癌患者生存质量及改进HCC的治疗手段都具有重要意义。大量的研究证实癌细胞的迁移侵袭一般要经历的过程是，肿瘤细胞外基质降解，肿瘤细胞运动性增强，穿越基底膜进入循环系统，然后通过免疫逃避机制在新的部位形成新的肿瘤组织。而在这个过程当中，上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)起到了不可或缺的作用。EMT是指呈现上皮样表型的细胞失去极性，表现出增强的活动能力，在细胞基质间能够自由移动且呈现间质样表型的转化过程，这一过程促进了癌细胞的迁移和侵袭。越来越多的证据表明EMT是肝癌细胞发生侵袭和转移的关键动力[2-4]。目前已知参与诱导及调控肝癌细胞发生EMT的因素很多，包括生长因子的诱导、转录因子的调节、信号通路的调控及低氧等因素[5-12]。然而，所有这些因素中，对微环境的研究关注较少。实体瘤细胞外具有较低的pH值(pH 6.2～pH 6.9)，而正常细胞为pH 7.1～pH 7.4，这种酸性的环境是肿瘤微环境的重要特征[14]，而这种酸性环境是否与肝癌的EMT有关尚未可知。本研究小组在前期实验中观察到在酸性条件下培养肝癌HepG2细胞发生了上皮向间质转变的形态变化，因此，本研究将在此基础上进一步探索酸性环境对肝癌HepG2细胞EMT的影响，旨在揭示肝癌EMT发生的机理，为临床靶向肿瘤酸性微环境研究治疗方案提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2细胞系购于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)；DMEM培养基及FBS购于美国Hyclone公司；兔抗人Vimentin抗体及兔抗人E-cadherin抗体购于博奥森公司；兔抗人MMP9抗体及兔抗人MMP10抗体购于美国ABclonal公司；Transwell小室购于美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及形态观察 将肝癌HepG2细胞分别在酸性(pH 6.8)和碱性(pH 7.4)条件下培养，培养基为含10%胎牛血清DMEM，培养基的pH值用HCL及NaOH溶液调整，并添加Hepes溶液稳定pH，用pH计检测确定。在37℃二氧化碳培养箱中进行常规培养传代，每日换液，保证培养环境的pH值。每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态，当细胞形态发生明显EMT变化时，进行拍照。分别在酸性和碱性条件下培养三代后进行后续所有的检测。

1.2.2 划痕实验检测细胞的迁移能力 先用记号笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5～1 cm一道，横穿过孔，每孔至少划5条线。将在酸性和碱性条件下培养的细胞分别在孔中接种约5×105个细胞，待细胞长满后，换上无血清培养液培养24 h后，用200 μL枪头比着直尺，在孔中尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去除划掉的细胞，加入对应培养环境的培养基，在培养0 h及24 h时分别进行拍照。IMAGE J软件测定各划痕宽度，从而得到细胞迁移距离。

1.2.3 Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭能力 提前配制1% Matrigel溶解于无血清DMEM(4℃)中，再将Transwell小室置于24孔板中，将配好的Matrigel 250 μL加入小室。2 h后，吸弃小室中溶胶的DMEM，立即将两组细胞分别用无血清DMEM制成细胞悬液，取2×104个细胞种于铺有Matrigel基质胶Transwell小室中，细胞悬液体积为200 μL，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM，置于5%CO2培养箱培养24 h。取出Transwell小室，吸弃小室内液体，用棉签擦净上室细胞，PBS漂洗后甲醇固定30 min，结晶紫染色30 min，PBS漂洗10 min，倒置显微镜下观察并拍照，每组计数5个视野统计分析比较两组穿过Matrigel胶的细胞数。

1.2.4 RT-PCR检测EMT相关基因的表达 用Trizol提取两组细胞总RNA，以RNA为模板逆转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR反应。检测基因为EMT相关基因，包括Vimentin，E-cadherin，β-catenin，Zeb1，Snail，Slug。各基因引物序列为：Vimentin上游：5′-GACGCCATCAACACCGAGTT-3′，下游：5，-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3′；E-cadherin上游：5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′，下游：5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；β-catenin上游：5′-CACAAGCAGAGTGCTGAAGGTG-3′，下游：5′-GATTCCTGAGAGTCCAAAGACAG-3′；Zeb1上游：5′-GCTGGCAAGACAACGTGAAAG-3′，下游：5′-AGGATAAATGACGGCGGTGT-3′；Snail上游：5′-TGCCCTCAAGATGCACATCCGA-3′，下游：5′-GGGACAGGAGAAGGGCTTCTC-3′；Slug上游：5′-CGAACTGGACACACATACAGTG-3′，下游：5′-CTGAGGATCTCTGGTTGTGGT-3′。反应体系为：5 μL SYBR Green PCR Master Mix，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，补水至总体积10 μL。扩增程序为：95℃，5 min；95℃，15 s，58℃，15 s，72℃，20 s；共32个循环，以β-actin为内参。用Tanon分析软件获得条带灰度值，并与内参灰度值比较得出每次实验的相对数值，实验重复三次进行统计分析。

1.2.5 Western blot检测EMT相关蛋白的表达 提取两组细胞总蛋白，与5×加样缓冲液混匀，煮沸5 min。取20 μg蛋白，用10%SDS-PAGE分离电转移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，加入E-cadherin(1∶500)、Vimentin(1∶100)、MMP9(1∶200)、MMP10(1∶200)及GAPDH(1∶500)抗体稀释液4℃摇动孵育过夜。0.1%TBST洗膜3次，再加入AP标记的二抗(1∶1000)，室温反应1 h，0.1%TBST洗膜3次，加入AP显色液避光孵育一定时间后检测蛋白条带。用Tanon分析软件将图片上的特异条带灰度值数字化，并与内参灰度值比较得出每次实验的相对数值，实验重复三次进行统计分析。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 酸性环境诱导HepG2细胞的形态从上皮型转变为间质型

在碱性条件下培养的HepG2细胞呈扁平不规则多角形，细胞彼此间连接紧密，呈鹅卵石样排列，是典型的上皮型细胞形态；在酸性条件下培养的HepG2细胞，呈纺锤形，更加细长，细胞间连接松散，表现为间质细胞的形态(图1)。

图1 酸性和碱性条件下HepG2细胞的形态Figure 1 Morphological changes of HepG2 in acid and alkaline conditions

图2 划痕实验Figure 2 The wound healing experiment in HepG2 cells

2.2 酸性环境增强HepG2细胞的迁移和侵袭能力

肿瘤细胞的迁移和侵袭能力即细胞的能动性，与EMT中活动能力细胞表型的形成有关，与肿瘤的浸润和转移密切相关。为检测酸性环境对HepG2细胞能动性的影响，本研究做了划痕实验及Matrigel侵袭实验。结果显示24 h时，酸性条件下的划痕距离(0.27±0.13)mm明显窄于碱性条件(0.63±0.29)mm，表明酸性条件下HepG2细胞迁移能力明显强于碱性条件下(P<0.05)(图2)。

Matrigel侵袭实验结果显示，24 h时，在酸性条件下穿过Matrigel的HepG2细胞的数量(27.3±4.7)明显多于碱性条件下(8.2±2.4)，表明酸性环境下HepG2细胞的侵袭力明显强于碱性条件下(P<0.05)(图3)。

2.3 酸性环境增强EMT相关基因的表达

从基因水平检测HepG2细胞在酸性和碱性条件下一系列EMT相关基因的表达，RT-PCR结果显示，在酸性条件下HepG2细胞EMT相关基因Vimentin、Slug、Snail及Zeb1的表达强度明显强于在碱性条件下，E-cadherin的表达轻度低于碱性条件，β-catenin的表达强度没有明显不同(表1，图4)。

通过Western blot检测酸性和碱性条件下的EMT相关基因在蛋白水平的表达，结果显示，酸性条件下Vimentin和MMP9的表达明显强于碱性条件下，MMP10的表达没有明显差异，E-cadhetin的表达在酸性条件下明显弱于碱性条件下(P<0.05)(图5)。

图3 Matrigel侵袭实验检测HepG2细胞侵袭力Figure 3 Invasive experiments were performed to assess invasive ability of HepG2 cellsNote：A.The representative micrographs of invasive experiment；B.Numbers of invasive cells；*P<0.05，compared to pH 7.4 conditions.

图4 RT-PCR检测EMT相关基因的表达Figure 4 RT-PCR was performed to assess the expression of EMT-regulating genesNote：A.Expression levels of EMT related genes mRNA；B.The levels of mRNA expression were statistical analysis.*P<0.05，**P<0.01，compared with pH 7.4 condition.

GenespH7.4pH6.8PVimentin0.42±0.051.3±0.150.004Slug0.15±0.030.38±0.060.037Snail0.08±0.010.27±0.030.024Zeb10.02±0.010.16±0.010.019β-catenin0.40±0.020.48±0.010.067E-cadherin0.16±0.010.12±0.010.045

图5 Western blot 检测EMT相关蛋白的表达Figure 5 The protein expression of EMT related genes were measured using Western blotNote：A.The protein expression of EMT related genes；B.The levels of protein expression were statistical analysis.

3 讨论

EMT在肝癌的迁移和侵袭过程中起到重要作用，目前已知参与诱导及调控肝癌细胞发生EMT的因素很多，包括：(1)生长因子的诱导：体外培养时添加生长因子如转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等可诱导肝癌细胞发生EMT[5-6]；(2)转录因子的调节：一些转录因子，包括Snail、Slug、Twist、Zeb1、Smad及核转录因子-κB(NF-κB)作为EMT调控过程中的下游因素，可抑制E-cadherin的转录水平，下调其表达，导致EMT[7-8]；(3)信号通路的调控：近来的研究通过建立细胞系模型，发现一些信号通路可以调控EMT，如TGF-β信号途径、Wnt/β-catenin通路、Notch信号通路及Hedgehog通路等[9-11]；(4)微环境：研究表明[12]，低氧环境可促进肝癌细胞发生EMT，肝癌细胞形态由上皮向间质改变，细胞功能发生变化，肝癌细胞的迁移及侵袭能力增强，远处转移能力增强。而酸性环境作为实体瘤微环境重要的特征之一，其对肝癌细胞EMT有无影响尚未可知。

由于实体瘤细胞迅速生长，而实体瘤组织往往血管异常导致血流灌注相对不足，无法提供高代谢需要的足够的氧，因此其代谢途径主要是通过糖酵解，导致细胞内大量乳酸堆积，大量的H+累积激活癌细胞膜表面的离子转运体系把胞内的氢离子转运到胞外，以升高细胞内的pH，同时肿瘤组织周围的组织环境无法及时清除大量从细胞内排除的H+，致使细胞外pH呈酸性，最终形成了肿瘤酸性微环境[13]。研究表明，这种酸性环境反过来促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。在酸性条件下培养的癌细胞，其侵袭和转移能力明显增加[14]。目前已知酸性环境通过多种方式使癌细胞的恶性程度增强，如上调VEGF等基因表达，促进肿瘤新生血管生成[15]；释放组织蛋白酶B和其他蛋白水解酶，导致细胞外基质降解[16]；抑制免疫细胞功能，导致癌细胞免疫逃逸[17]；促使肿瘤细胞对放疗不敏感并对化疗药物产生耐药性[18-19]。

酸性环境和EMT是两大影响肝癌细胞迁移和转移的重要因素，然而这二者之间的联系还不十分清楚，酸性环境提高肿瘤的恶性程度是否也与其对EMT的影响有关呢？有极少量的文献报道了这方面的研究，Suzuki等[20]的研究表明，酸性环境可以诱导小鼠肺癌细胞发生EMT。本研究在体外酸性环境下培养人肝癌HepG2细胞，发现细胞形态发生了明显的变化，由典型的上皮细胞形态变为间充质细胞的形态，进而我们进行体外迁移和侵袭力检测，以及在基因水平和蛋白水平检测EMT相关指标。结果显示，HepG2细胞在酸性环境下迁移能力和侵袭能力都明显强于在碱性条件下，间质标志Vimentin明显上调，细胞间黏附相关标志E-cadherin明显下调，侵袭相关蛋白MMP9明显表达上调，EMT关键信号通路Smad2和Erk1/2通路上的Zeb1、Snail和Slug基因的mRNA表达水平明显上调。

综上所述，酸性环境能诱导肝癌EMT的发生。相关的分子机理，本研究将在后续的研究中进行深入探索，例如筛查导致该现象发生的对酸敏感的信号通路。本研究首次从实体瘤细胞酸性微环境的角度探索肝癌细胞EMT的发生，通过形态变化，体外迁移和侵袭力检测，以及在基因水平和蛋白水平检测EMT相关指标，综合证明酸性微环境可能诱导肝癌HepG2细胞EMT的发生。本研究有助于指导基础研究和临床治疗过程中拟定EMT阻断方案以进一步提高肝癌治疗效果。

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(收稿：2016-09-28)

Acid conditions induces EMT of hepatocellular carcinoma HepG2 cells

ZHOUChunfang1，ZHAOShanshan2，SUNZequn1，WUJun1，ZHAHuolong1，YUANYahong2

1.Department of Gastroenterology，Renmin Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China；2.Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine

Objective The objective of this study was to investigate the effect of acidic conditions on epithelial mesenchymal transition(EMT)of HepG2 cells.Methods HepG2 cells were cultured under acidic and alkaline conditions to observe the difference of cell morphology.Wound healing assays were performed to detect the migration ability of the two groups.Matrigel invasion assays were used to detect the invasive ability of the cells.The expression of EMT-related genes at mRNA level was detected by RT-PCR.The expression level of EMT-related gene protein was detected by Western blot.Results The morphology of HepG2 cells was changed from epithelium to interstitial type under acid conditions.The migration ability of HepG2 cells under acidic condition was stronger than that of alkaline conditions.The number of HepG2 cells crossing Matrigel was higher than that of alkaline condition.The mRNA expression of Vimentin，Slug，Snail and Zeb1 related to EMT and the protein expression of Vimentin and MMP9 related to EMT in HepG2 cells were significantly higher than those under alkaline condition.Conclusion The acid conditions can induce the occurrence of EMT in HepG2 cells.

Acid conditions；Epithelial mesenchymal transition；Hepatocellular carcinoma；HepG2

十堰市科学技术研究与开发项目计划(16Y01)

1.湖北医药学院附属十堰市人民医院消化内科(十堰 442000)；2.湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室

周春芳，男，(1980-)，硕士，主治医师，从事消化道肿瘤治疗的研究。

袁雅红，E-mail：yyhmedicine@163.com

R735.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.002